Μελέτη του ανοσολογικού προφίλ καρκινικών δειγμάτων παχέος εντέρου με απενεργοποιημένη MLL3 μεθυλοτρανσφεράση

Σόνου, Χριστίνα

Study of the immune profile of colorectal cancer samples with inactivated MLL3 methyltransferase

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Σόνου, Χριστίνα

Date

2021-07-16

Advisor

Rampias, Theodoros

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία (2.304Mb)

Keywords

Επιγενετική ρύθμιση ; Ανοσοθεραπεία ; KMT2C ; TGFβ

Abstract

Εισαγωγή: Ο καρκίνος παχέος εντέρου αποτελεί έναν από τους πιο συχνά εμφανιζόμενους καρκίνους παγκοσμίως. Μια υποσχόμενη σύγχρονη θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση του αποτελεί η ανοσοθεραπεία. Έχει δειχθεί ότι τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που διηθούν όγκους παχέος εντέρου διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αντιμετώπισης του και ότι ο βαθμός της διήθησης έχει προγνωστική αξία για την εξέλιξη της νόσου. Υπάρχουν όμως παράγοντες που αποτρέπουν τη διήθηση του όγκου από κυτταρα του ανοσοποιητικού. Ένας από αυτούς είναι ο μεταμορφωτικός αυξητικός παράγοντας β (transforming growth factor β, TGFβ) όταν βρίσκεται ενεργοποιημένος στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκεκριμένα, δεδομένα υποδεικνύουν ότι το γονίδιο KMT2C (MLL3) υποεκφράζεται σε διαφορετικές νεοπλασίες, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος. Με δεδομένο ότι ο επιγενετικός αυτός τροποποιητής εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση πολλών γονιδίων στη χρωματίνη, η γονιδιακή αποσιώπηση του οδηγεί σε υποέκφραση πολλών γονιδίων στόχων του όπως είναι το ITGB6. Το γονίδιο ITGB6 κωδικοποιεί την ανβ6 πρωτεΐνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την ενεργοποίηση του μεταμορφωτικού αυξητικού παράγοντα β (transforming growth factor β, TGFβ). Η αποσιώπηση λοιπόν της ΜLL3 μεθυλοτρανσφεράσης οδηγεί στην υποέκφραση του γονιδίου ITGB6 και επηρεάζει την παραγωγή της ιντεγκρίνης ανβ6 και κατ΄ επέκταση την ενεργοποίηση του TGFβ και τη διήθηση καρκινικών όγκων απο κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Σκοπός: Ο εντοπισμός διαφορών στο πρότυπο διήθησης από CD8a κύτταρα του ανοσοποιητικού σε καρκινικά δείγματα παχέος εντέρου με απενεργοποιημένη ΜLL3 μεθυλοτρανσφεράση (#1500) σε σχέση με καρκινικά δείγματα ελέγχου όπου η MLL3 μεθυλοτρασφεράση εκφράζεται φυσιολογικά. Μέθοδος: Σε μια ομάδα από BALB/c μύες ενέθηκαν CT26 κύτταρα (control) και σε μία δεύτερη CT26 κύτταρα με αποσιώπηση της MLL3 μεθυλοτρασφεράσης (#1500). Στους όγκους που αναπτύχθηκαν και στις δύο ομάδες πραγματοποιήθηκαν λήψεις τομών παραφίνης και εφαρμόστηκε πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας για τον εντοπισμό των CD8a κυττάρων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μικροσκοπική ανάλυση, ψηφιακή απεικόνιση και τέλος στατιστική ανάλυση. Αποτελέσματα: Παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική αύξηση του ποσοστού των CD8a ογκοδιηθητικών λεμφοκυττάρων σε καρκινικά δείγματα με απενεργοποίηση της MLL3 μεθυλτρανσφεράσης. Συμπεράσματα: Φαίνεται ότι στα καρκινικά κύτταρα που έχει πραγματοποιηθεί απενεργοπoίηση της MLL3 μεθυλτρανσφεράσης, αυτή συνοδεύεται απο αναστολή του μονοπατιού ενεργοποίησης του TGFβ και αύξηση του ποσοστού διήθησης από CD8a λεμφοκύτταρα.

Abstract

Introduction: Colorectal cancer is one of the most commonly diagnosed cancers worldwide. A promising modern therapeutic approach regarding colon cancer is immunotherapy. It has been shown that cells of the immune system that infiltrate colon tumors play an important role in the treating process and that the degree of infiltration has prognostic value. However, there are factors that prevent tumor infiltration by immune cells. One of these factors is transforming growth factor β (TGFβ) when is found activated in the tumor microenvironment. Data suggest that KMT2C gene (MLL3) is underexpressed in various cancers, including colorectal adenocarcinoma. Because this epigenetic modifier is involved in the transcriptional regulation of many genes in chromatin, its gene silencing leads to underexpression of many of its target genes such as ITGB6. ITGB6 gene encodes αvβ6 protein, which is responsible for activating transforming growth factor β (TGFβ). Silencing of MLL3 methyltransferase leads to underexpression of ITGB6 gene and affects the production of αvβ6 integrin and consequently the activation of TGFβ and the infiltration of tumors by cells of the immune system. Purpose: Detection of differences in CD8a immune cells infiltration pattern in colorectal cancer tumors with inactivated MLL3 methyltransferase (#1500) compared to control tumor samples where MLL3 methyltransferase is normally expressed. Method: CT26 cells (control) and MLL3 methyltransferase silenced CT26 cells (#1500) were injected in a group of BALB/c mice respectively. From the tumors developed in both groups paraffin slides were obtained and immunohistochemistry protocol was applied for the detection of CD8a cells. Microscopic analysis, digital imaging and statistical analysis were performed. Results: We observed a statistically significant increase of CD8a tumor infiltrating lymphocytes rate in tumors with inactivated MLL3 methyltransferase. Discussion: It appears that MLL3 methyltransferase inactivation is accompanied by inhibition of the TGFβ activation pathway and increase of the percentage of CD8a tumor infiltrating lymphocytes.