Μοριακή ανίχνευση του πλασμιδιακού γονιδίου που παρέχει αντοχή στην κολιστίνη σε δείγματα από χοίρους.

Αυγέρη, Ερμιόνη

Molecular detection of the plasmidic gene that provides colistin resistance in pig samples.

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Αυγέρη, Ερμιόνη

Date

2022-10-03

Advisor

Γιακκούπη, Παναγιώτα
Beloukas, Apostolos

Μεταπτυχιακή εργασία (1.756Mb)

Keywords

Κολιστίνη ; Escherichia coli ; Mcr-1 ; Μικροβιακή αντοχή

Abstract

Η μικροβιακή αντοχή αποτελεί μία από τις μεγαλύτερες απειλές για τον άνθρωπο τον 21ο αιώνα. Tα αυξημένα επίπεδα χορήγησης αντιβιοτικών στους ανθρώπους και στα ζώα για την προαγωγή της δημόσιας υγείας έχει βοηθήσει στην επικράτηση πολυανθεκτικών βακτηρίων. Η ανάπτυξη της αντοχής παρουσιάζεται ιδιαίτερα στα gram αρνητικά βακτήρια καθώς διαφοροποιείται και εξαπλώνεται με γρήγορους ρυθμούς με αποτέλεσμα ακόμα και αντιβιοτικά της τελευταίας γραμμής να μην είναι αποτελεσματικά και όχι μόνο σε ανοσοκατεσταλμένους αλλά και σε ασθενείς χωρίς υποκείμενα νοσήματα. Ωστόσο, το 2015 αναφέρθηκε για πρώτη φορά στην Κίνα το γονίδιο αντοχής mcr-1 (mobilized colistin resistance) το οποίο εδράζεται πάνω σε πλασμίδιο που έχει σαν αποτέλεσμα να μεταφέρεται και να διασπείρει εύκολα τη μικροβιακή αντοχή. Επιπλέον, η επικράτηση μικροβίων που παράγουν ευρέος φάσματος β-λακταμάσες (Extended-Spectrum β-lactamases) έχουν ανησυχήσει την επιστημονική κοινότητα διότι εμφανίζονται κυρίως σε νοσοκομειακούς ασθενείς, αλλά και στην κοινότητα και την κτηνοτροφία. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η απομόνωση του μικροβίου Escherichia coli σε διαρροϊκά δείγματα από χοίρους, τα οποία προήλθαν από 5 διαφορετικές εκτροφές στην Ελλάδα και η ανίχνευση του γονιδίου αντοχής mcr. Ακολουθεί, φαινοτυπική και μοριακή ανίχνευση ESBLs, έλεγχος της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης στην κολιστίνη καθώς και μοριακή τυποποίηση των στελεχών Escherichia coli και σύγκριση των μοριακών αποτυπωμάτων. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σύζευξης με υγρές καλλιέργειες για να ελεγχθεί η δυνατότητα αυτό-μετακίνησης των πλασμιδίων στα οποία εδράζονται τα γονίδια αντοχής mcr & ESBL. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε 4 από τις 5 εκτροφές ανιχνεύθηκε το γονίδιο αντοχής mcr-1 και καμία άλλη παραλλαγή του. Οι ESBLs ανήκουν στις ομάδες CTX-M-3 και SHV-12 που είναι ευρέος διαδεδομένες. Η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση κολιστίνης κυμαινόταν από 0,5 mg/L έως >64 mg/L με MIC50 τα 8 mg/L. Η μοριακή τυποποίηση έδειξε πολύ μεγάλη ποικιλομορφία, γεγονός που αποδεικνύει καλές συνθήκες υγιεινής στις εκτροφές. Στη συνέχεια, επιλέχθηκαν πέντε στελέχη από ομάδες που περιλάμβαναν 5 στελέχη και πάνω και τυποποιήθηκαν με MLST. Τουλάχιστον 25% των στελεχών ανήκαν στο διεθνή υψηλού κινδύνου κλώνο ST88, που σύμφωνα με τη βιβλιογραφία προκαλεί λοιμώξεις σε ανθρώπους και ζώα. Η παρουσία του ST88, αναδεικνύει την αντοχή στην κολιστίνη που σημαίνει ότι πρέπει να αντιμετωπιστεί ολιστικά. Τέλος, όλα τα πλασμίδια ήταν συζευκτικά, με υψηλές συχνότητες μεταβίβασης.

Abstract

Antimicrobial resistance is one of the biggest threats to humans in the 21st century. Increased levels of antibiotics in humans and animals to promote public health have helped the prevalence of multidrug-resistant bacteria. The development of resistance is particularly pronounced in gram negative bacteria as it differentiates and spreads rapidly with the result that even last-line antibiotics are not effective not only in immunosuppressed but also in patients without underlying diseases. However, in 2015, the mcr-1 resistance gene (mobilized colistin resistance) was reported for the first time in China, which is based on a plasmid that has the effect of easily transporting and dispersing microbial resistance. In addition, the retention of microbes that produce broad-spectrum β-lactamases (Extended-Spectrum β-lactamases) has worried the scientific community because they occur mainly in hospital patients, but also in the community and livestock. The aim of this dissertation is the isolation of the Escherichia coli bacterium in diarrheal samples from pigs, which came from 5 different farms in Greece and the detection of the mcr resistance gene. This is followed by phenotypic and molecular detection of ESBLs, control of the minimum inhibitory concentration in colistin as well as molecular standardization of e.coli strains and comparison of molecular fingerprints. Finally, liquid culture coupling experiments were performed to test the self-mobility of plasmids on which the mcr & ESBL resistance genes are located. The results show that in 4 of the 5 breeds the mcr-1 resistance gene was detected and no other variant of it. ESBLs belong to the widespread CTX-M-3 and SHV-12 groups. The minimum inhibitory concentration of colistin ranged from 0.5mg / L to> 64mg / L with a MIC50 of 8mg / L. Molecular standardization showed great diversity, which proves good hygiene conditions in farms. Then, five strains were selected from groups of 5 strains and above and standardized with MLST. At least 25% of the strains belonged to the international high-risk clone ST88, which according to the literature causes infections in humans and animals. The presence of ST88 highlights the resistance to colistin which means that it must be treated holistically. Finally, all plasmids were conjugated, with high transfer frequencies.