Αξιολόγηση αιματολογικών παραμέτρων και εξωκυτταρικών κυστιδίων για τη διάγνωση ασθενών με μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) ως μη επεμβατικοί διαγνωστικοί βιοδείκτες: συσχέτιση με την παράμετρο εξασθένησης υπερήχων (UAP)

Τριφύλλη, Ελένη Μυρτώ Μαρία

Evaluation of hematological parameters and extracellular vesicles for the diagnosis of patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) as non-invasive diagnostic biomarkers: a correlation with Ultrasound Attenuation Parameter (UAP)

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Τριφύλλη, Ελένη Μυρτώ Μαρία

Date

2023-02-10

Advisor

Kriebardis, Anastasios

Κύριο άρθρο (1.880Mb)

Keywords

Εξωκυττάρια κυστίδια ; Φερριτίνη ; Μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα ; Παράμετρος εξασθένησης υπερήχων

Abstract

Εισαγωγή: Υπάρχει μια αξιοσημείωτη αύξηση των χρόνιων ηπατικών παθήσεων τις τελευταίες δεκαετίες, όπως της μη αλκοολικής λιπώδους νόσου του ήπατος (NAFLD), με το 30% των ασθενών να παρουσιάζει περαιτέρω ηπατοκυτταρική φλεγμονή, τη λεγόμενη μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH), με έλλειψη ή όχι ινωτικής βλάβης. Αιματολογικοί παράγοντες όπως η φερριτίνη παρότι θεωρείται μία παράμετρος οξείας φάσης, παρουσιάζει αύξηση σε ασθενείς με μη αλκοολική λιπώδη νόσο,ωστόσο, δεν είναι ευρέως αποδεκτή η συσχέτιση αυτής της παραμέτρου με την σοβαρότητα της ΝΑSH. Υπάρχει ένα ευρύ φάσμα κυττάρων στο ηπατικό παρέγχυμα, από τα οποία παράγονται εξωκυτταρικά κυστίδια (Extracellular vesicles EVs), κάποιοι ετερογενείς υποπληθυσμοί νανοδομών σε περιπτώσεις στρες όπως η λιποτοξικότητα, οδηγώντας σε ηπατοκυτταρική βλάβη και σε ανάπτυξη ηπατοπαθειών όπως η NASH. Αλλαγές στην ποσότητα των EVs και των μορίων που μεταφέρουν οδηγεί σε φλεγμονώδη αντίδραση και σταδιακά σε ηπατοκυτταρική βλάβη. Σε αυτή την μελέτη θα αξιολογήσουμε την φερριτίνη ως δείκτη σοβαρότητας της ΝASH και θα αξιολογήσουμε την παρουσία και τον συνολικό αριθμό των EVs ως εν δυνάμει μη επεμβατικούς βιοδείκτες για την σοβαρότητα της νόσου. Σκοπός: Στην έρευνα μας θα αξιολογήσουμε αιματολογικές παραμέτρους, ιδίως τα επίπεδα φερριτίνης και την ύπαρξη εξωκυτταρικών κυστιδίων για τη διάγνωση ασθενών με μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) ως μη επεμβατικούς διαγνωστικούς βιοδείκτες (αριθμός και μέγεθος αυτών) και θα συσχετίσουμε τα δεδομένα αυτά με την παράμετρο εξασθένησης υπερήχων (UAP) ως προς την σοβαρότητα της νόσου. Μέθοδος: Επιλέχθηκαν 32 ασθενείς που δεν πάσχουν από διαβήτη και σοβαρά συνοδά νοσήματα (πχ. ηπατίτιδες, καρκίνο κ.α.), οι οποίοι έδωσαν συγκατάθεση για την συλλογή αιματολογικών και βιοχημικών δειγμάτων αίματος, στα οποιά αξιολογήθηκαν οι παράγοντες πήξης, η φερριτίνη, καθώς και η παρουσία εξωκυτταρικών κυστιδίων μέσω του οργάνου Panalytic NanoSight με δεδομένα την συγκέντρωση, κατανομή και μέγεθος των σωματιδίων. Αποτελέσματα: Η συνολική διαγνωστική ακρίβεια των επιπέδων φερριτίνης στην καμπύλη ROC-AUC ήταν 0.843 (95% CI: 0.671-0.947, p<0.0001) με βέλτιστο διαγνωστικό όριο >278ng/ml (ευαισθησία 64.7% και ειδικότητα 93.3%), του ΒΜΙ ήταν 0.808 (95% CI: 0.63-0.925, p=0.0005) με βέλτιστο διαγνωστικό όριο >27.04 (ευαισθησία 88.2% και IX ειδικότητα 80%) και του HSI ήταν 0.731 (95% CI: 0.546-0.872, p=0.0097) με βέλτιστο διαγνωστικό όριο >40.9 (ευαισθησία 70.6% και ειδικότητα 73.3%). Στη λογιστική ανάλυση παλινδρόμησης τα επίπεδα φερριτίνης (OR: 1.0124, 95% CI: 1.002-1.023, p=0.0199) και το BMI (OR: 1.4166, 95% CI: 1.0153-1.9766, p=0.0404) αποτελούσαν προγνωστικούς δείκτες στεάτωσης με βάση το UAP. Επιπροσθέτως, τα μέσα επίπεδα φερριτίνης ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς με στεάτωση βαρύτητας S3 σε σχέση με αυτούς με S1 (454.83ng/ml vs. 228ng/ml, p=0.044). Στο δεύτερο σκέλος της μελέτης, η ύπαρξη στεάτωσης ( UAP ≥244) συσχετίστηκε με την ύπαρξη αυξημένων επιπέδων κυστιδίων στο πλάσμα των ασθενών,ενώ η βαρύτητα της στεάτωσης ήταν ανάλογη των επιπέδων των κυστιδίων με σημαντικά αυξημένα επίπεδα στις περιπτώσεις με S3 βαθμού στεάτωσης και μικρή διαφορά στα άτομα με S1-S2. Τέλος, η μέτρηση της μέσης πυκνότητας των κυστιδίων στο πλάσμα ανέδειξε ευαισθησία 92,3% και ειδικότητα 69,2% ως μέθοδος συσχέτισης της βαρύτητας της στεάτωσης – μεγέθους UAP. Συμπεράσματα: Οι μισοί ασθενείς με στεάτωση έχουν αυξημένα επίπεδα φερριτίνης , τα οποία μπορούν να βοηθήσουν στη διάγνωση και στη βαρύτητα της στεάτωσης σε ασθενείς με ΜΑΛΝΗ. Η ύπαρξη στεάτωσης ( UAP ≥244) συσχετίζεται με την ύπαρξη αυξημένων επιπέδων κυστιδίων στο πλάσμα των ασθενών με την βαρύτητα της στεάτωσης να είναι ανάλογη των επιπέδων των κυστιδίων με σημαντικά αυξημένα επίπεδα στις περιπτώσεις με S3 βαθμού στεάτωσης.

Abstract

Introduction: Τhere is a marked increase in chronic liver disease in the recent decades, such as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), with 30% of NAFLD patients developing further hepatocellular inflammation, the so-called non-alcoholic steatohepatitis (NASH), with or without fibrosis. Ferritin is considered an acute phase parameter, although it is increased in patients with NAFLD. However, the association between this parameter and the severity of NASH is not widely accepted. There is a wide range of cells in the hepatic parenchyma that produce extracellular vesicles (EVs) under stress such as lipotoxicity, which constitute heterogeneous subpopulations of nanostructures, leading to hepatocellular damage and the development of NASH. Changes in the amount of EVs and the molecules that they carry lead to an inflammatory reaction and gradually to hepatocellular damage. In this study, we will evaluate ferritin as an indicator of the severity of NASH and the presence of the total number of EVs as potential non-invasive biomarkers of the disease severity. Purpose: In our research, we will evaluate hematological parameters, more particularly, ferritin levels and the presence of extracellular vesicles in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) as non-invasive diagnostic biomarkers (number and size of them) and we will correlate these data with ultrasound attenuation parameter (UAP) with the severity of the disease. Method: It was selected a total of 32 patients who do not present diabetes and other serious comorbidities (eg hepatitis, cancer, etc.) consented to the collection of hematological and biochemical blood samples, in which we examined the coagulation factors, ferritin, and the presence of extracellular vesicles via the use of Panalytic NanoSight instrument, with produced data about the concentration, the distribution and the size of the particles. Results: The overall diagnostic accuracy of ferritin levels in the ROC-AUC curve was 0.843 (95% CI: 0.671-0.947, p<0.0001) with an optimal diagnostic cutoff >278ng/ml (sensitivity 64.7% and specificity 93.3%), of BMI was 0.808 ( 95% CI: 0.63-0.925, p=0.0005) with an optimal diagnostic threshold >27.04 (sensitivity 88.2% and specificity 80%) and of HSI was 0.731 (95% CI: 0.546-0.872, p=0.0097) with an optimal diagnostic threshold > 40.9 (sensitivity 70.6% and specificity 73.3%). In logistic regression analysis ferritin levels (OR:XI 1.0124, 95% CI: 1.002-1.023, p=0.0199) and BMI (OR: 1.4166, 95% CI: 1.0153-1.9766, p=0.0404) were predictive markers of steatosis based on the UAP. Finally, mean ferritin levels were statistically significantly higher in patients with steatosis of S3 severity than those with S1 (454.83ng/ml vs. 228ng/ml, p=0.044). In the second arm of the study, the existence of steatosis (UAP ≥244) was associated with the existence of increased levels of vesicles in the patients' plasma, while the severity of steatosis was proportional to the levels of vesicles with significantly increased levels in the cases with S3 steatosis grade and a small difference in those with S1-S2. Finally, measurement of mean plasma vesicle density revealed a sensitivity of 92.3% and a specificity of 69.2% as a method of correlating steatosis severity – UAP. Discussion: Half of the patients, who present steatosis, concomitantly present increased levels of Ferritin, while ferritin levels could be useful for the diagnosis and the estimation of NAFLD severity. The presence of steatosis (UAP ≥244) is associated with the presence of increased plasma levels of vesicles, with the severity of steatosis being proportional to the increased levels of the vesicles, especially in patients with S3 grade steatosis.