Μελέτη Κρυοαιμόλυσης στα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα

Κυριτσάκη, Ηλιάνα

Study of Cryohemolysis in Myelodysplastic Syndromes

Πτυχιακή εργασία

Author

Κυριτσάκη, Ηλιάνα

Date

2023-07-19

Advisor

Κριεμπάρδης, Αναστάσιος

ΚΥΡΙΤΣΑΚΗ ΗΛΙΑΝΑ-ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ.pdf (3.344Mb)

Keywords

Κρυοαιμόλυση ; Αιμοποίηση ; Ερυθροποίηση ; Δυσερυθροποίηση ; Άμεση Coombs ; MDS ; Ερυθροκύτταρα ; Ερυθροκυτταρική διαφοροποίηση ; Ερυθροκυτταρική μεμβράνη ; Ερυθροκυτταρικός κυτταροσκελετός ; Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα ; Ερυθρά αιμοσφαίρια ; Μυελός των οστών ; Δομή ερυθροκυττάρων ; Ερυθροκυτταρική δυσπλασία ; Ιδιότητες ερυθρών αιμοσφαιρίων

Abstract

Η παρούσα εργασία στοχεύει στη μελέτη της επίδρασης της δοκιμασίας κρυοαιμόλυσης στα ερυθρά αιμοσφαίρια ασθενών με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ/MDS). Τα ερυθρά αιμοσφαίρια ή ερυθροκύτταρα αποτελούν τον πολυπληθέστερο κυτταρικό τύπο του αίματος κι είναι υπεύθυνα για πολλαπλές διαδικασίες, ύψιστης σημασίας για τη ζωή, όπως η μεταφορά του οξυγόνου από τους πνεύμονες στους ιστούς, μέσω της αιμοσφαιρίνης, η αιμόσταση, η ρύθμιση της ροής του αίματος και του αγγειακού τόνου, ακόμα και η μεταφορά ανοσοσυμπλεγμάτων. Χαρακτηρίζονται για την ιδιαίτερη μορφολογία τους, η οποία ομοιάζει με αμφίκοιλο δίσκο, και συντίθεται από την ευέλικτη πλασματική μεμβράνη και το υποκείμενο κυτταροσκελετικό δίκτυο. Το κυτταρόπλασμα τους υπολείπεται οργανιδίων, ενώ είναι πλούσιο σε αιμοσφαιρίνη. Τα ερυθροκύτταρα παράγονται από τον μυελό των οστών, μέσω μιας εξαιρετικά πολύπλοκης διαδικασίας, η οποία ονομάζεται ερυθροποίηση και περιλαμβάνει μια σειρά διακριτών σταδίων ωρίμανσης. Βασική ιδιότητα των ερυθροκυττάρων αποτελεί η παραμορφωσιμότητα ή προσαρμοστικότητα (deformability), δηλαδή η ικανότητα τους να τροποποιούν το σχήμα και τη μορφολογία τους, ως απόκριση στις συνθήκες της ροής του αίματος, και στη συνέχεια να τα ανακτούν, όταν επέρχονται οι φυσιολογικές συνθήκες, μηχανισμός που τα προστατεύει από τη ρήξη, κατά τη διακίνηση τους στην κυκλοφορία. Η ρήξη των ερυθροκυττάρων καλείται αιμόλυση και εκδηλώνεται με την απελευθέρωση της αιμοσφαιρίνης στο πλάσμα του αίματος. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια στα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα παρουσιάζουν πολυάριθμες μορφολογικές ανωμαλίες, λόγω της δυσερυθροποίησης που λαμβάνει χώρα κατά την ανάπτυξη αυτών των συνδρόμων. Ειδικότερα, τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα συνιστούν μια ετερογενή και σύνθετη ομάδα κλωνικών αιματολογικών κακοηθειών, με κοινή προέλευση το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο (HSC), το οποίο βρίσκεται στην κορυφή της αιμοποιητικής ιεραρχίας. Κύριο γνώρισμα αυτών των συνδρόμων αποτελεί η αναποτελεσματική αιμοποίηση, η οποία συνοδεύεται από αυξημένη απόπτωση των κυττάρων του μυελού των οστών, κυτταροπενία στο περιφερικό αίμα, παρουσία βλαστών, τόσο στο μυελό, όσο και στην κυκλοφορία, και μορφολογική δυσπλασία σε μία ή περισσότερες κυτταρικές σειρές. Η αναποτελεσματική αιμοποίηση οφείλεται σε μια πληθώρα μοριακών διαταραχών, οι οποίες διενεργούνται στα αρχικά στάδια της αιμοποίησης κι επηρεάζουν κυρίως τη μυελοειδή σειρά, όπως μεταλλάξεις στη συρραφή του RNA, στους μεταγραφικούς παράγοντες της αιμοποίησης, τις διεργασίες τις επιγενετικής ρύθμισης, τις οδούς σηματοδότησης, καθώς και κυτταρογενετικές και ανοσολογικές διαταραχές. Αυτές οι μοριακές διαταραχές μπορεί να είναι απόρροια είτε πρωτοπαθών αιτιών, όπως η γήρανση και οι στρεσσογόνες καταστάσεις, που επάγουν την αιμοποίηση, είτε δευτεροπαθών αιτιών, όπως η αντινεοπλασματική και ανοσοκατασταλτική θεραπεία. Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα αποτελούν νοσήματα που επηρεάζουν κυρίως την τρίτη ηλικία, με μέση ηλικία εμφάνισης τα 70 έτη, ενώ η κλινική τους εικόνα μπορεί να κυμαίνεται από αναιμία, ευαισθησία στις λοιμώξεις κι ανεπαρκή πήξη του αίματος, έως μετασχηματισμό σε οξεία μυελογενή λευχαιμία. Στη συγκεκριμένη μελέτη, αρχικά διεξάχθηκε αιματολογική ανάλυση δειγμάτων αίματος από ασθενείς με ΜΔΣ και υγιή άτομα και στη συνέχεια εκτελέστηκε η δοκιμασία της κρυοαιμόλυσης και το τεστ Άμεσης Coombs. Η δοκιμασία της κρυοαιμόλυσης περιλαμβάνει την επώαση των ερυθροκυττάρων σε υπέρτονο μέσο, σε αρχική θερμοκρασία 37ο C και την μετέπειτα ψύξη τους σε θερμοκρασία 0ο C. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η απότομη αλλαγή της θερμοκρασίας προκαλεί μετάβαση φάσης της λιπιδικής διπλοστιβάδας της μεμβράνης από υγρή σε μορφή gel, επιδρώντας στους κατακόρυφους δεσμούς μεταξύ της μεμβράνης και του κυτταροσκελετού, με συνέπεια τη ρήξη της μεμβράνης και κατ΄ επέκταση του κυττάρου. Το ποσοστό των κυττάρων που υπέστησαν ρήξη, δηλαδή το ποσοστό της κρυοαιμόλυσης, υπολογίζεται με την μέτρηση της ελεύθερης αιμοσφαιρίνης στο πλάσμα του αίματος. Το τεστ κρυοαιμόλυσης χρησιμοποιείται ευρέως για τη διάγνωση της κληρονομικής σφαιροκυττάρωσης, αιματολογική διαταραχή που χαρακτηρίζεται για τις δομικές βλάβες στον κυτταροσκελετό και το σχήμα των ερυθροκυττάρων. Ως εκ τούτου, η διεξαγωγή αυτού του πειράματος σε ασθενείς με ΜΔΣ μπορεί να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της μορφολογίας των δυσπλαστικών ερυθροκυττάρων. Ακόμα, με το τεστ Άμεσης Coombs μπορεί να αποδειχθεί η παρουσία αντισωμάτων ή συμπληρώματος στην επιφάνεια των ερυθροκυττάρων, η οποία πιθανόν να υποδηλώνει αυτοάνοσες εκδηλώσεις στο περιφερικό αίμα των ασθενών. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν την ύπαρξη αναιμίας, λευκοπενίας και θρομβοπενίας στους ασθενείς, με παράλληλη αύξηση των δεικτών MCV, MCH, RDW, PDW και MPV και τη μείωση τoυ δείκτη MCHC. Τα αποτελέσματα της κρυοαιμόλυσης ήταν σχεδόν ίδια στην ομάδα των ασθενών και των υγιών ατόμων, με αυτά των ασθενών να είναι ελαφρώς χαμηλότερα. Κατά συνέπεια, η συγκεκριμένη μελέτη δεν επέδειξε κάποια διαφορά όσον αφορά την επίδραση της κρυοαιμόλυσης στα ερυθρά αιμοσφαίρια των ασθενών, συγκριτικά με αυτά των υγειών. Τέλος, τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα βρέθηκαν αρνητικά στο τεστ της Άμεσης Coombs, επομένως δεν αναγνωρίστηκαν αυτοάνοσα φαινόμενα στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΔΣ.

Abstract

The present study aims to investigate the effect of cryohemolysis test on red blood cells of patients with myelodysplastic syndromes (MDS/MDS). Red blood cells or erythrocytes are the most numerous cell type in the blood and are responsible for multiple processes of utmost importance for life, such as the transport of oxygen from the lungs to the tissues via hemoglobin, hemostasis, regulation of blood flow and vascular tone, and even the transport of immune complexes. They are characterised by their particular morphology, which resembles a biconcave disc, and are composed of the flexible plasma membrane and the underlying cytoskeletal network. Their cytoplasm is deficient in organelles and rich in haemoglobin. Erythrocytes are produced by the bone marrow through a highly complex process called erythropoiesis, which involves a series of distinct maturation stages. A key property of erythrocytes is their deformability, i.e. their ability to modify their shape and morphology in response to blood flow conditions and then to recover them when normal conditions occur, a mechanism that protects them from rupture as they move through the circulation. The rupture of erythrocytes is called haemolysis and is manifested by the release of haemoglobin into the blood plasma. Red blood cells in myelodysplastic syndromes show numerous morphological abnormalities due to the dysregulation that occurs during the development of these syndromes. In particular, myelodysplastic syndromes constitute a heterogeneous and complex group of clonal haematological malignancies, with a common origin being the hematopoietic stem cell (HSC), which is at the top of the haematopoietic hierarchy. The main feature of these syndromes is inefficient haematopoiesis, accompanied by increased apoptosis of bone marrow cells, cytopenia in peripheral blood, the presence of blasts both in the marrow and in the circulation, and morphological dysplasia in one or more cell lines. Inefficient haemopoiesis is caused by a variety of molecular perturbations that occur in the early stages of haemopoiesis and mainly affect the myeloid lineage, such as mutations in RNA splicing, transcription factors in haemopoiesis, epigenetic regulation processes, signalling pathways, and cytogenetic and immunological disorders. These molecular perturbations may result from either primary causes, such as ageing and stressors that induce haematopoiesis, or secondary causes, such as antineoplastic and immunosuppressive therapy. Myelodysplastic syndromes are diseases that mainly affect the elderly, with a mean age of onset of 70 years, and their clinical presentation can range from anaemia, susceptibility to infections and poor blood clotting, to transformation into acute myeloid leukaemia. In this study, hematological analysis of blood samples from patients with MDS and healthy people was initially performed, followed by cryohemolysis and Coombs Direct test. The cryohemolysis test involves the incubation of erythrocytes in hypertonic medium at an initial temperature of 37o C and their subsequent cooling to 0o C. According to previous studies, the abrupt change in temperature causes a phase transition of the lipid bilayer of the membrane from liquid to gel form, affecting the vertical bonds between the membrane and the cytoskeleton, resulting in rupture of the membrane and consequently the cell. The percentage of ruptured cells, i.e. the percentage of cryohemolysis, is calculated by measuring the free hemoglobin in the blood plasma. The cryohemolysis test is widely used to diagnose hereditary spherocytosis, a hematological disorder characterized by structural defects in the cytoskeleton and shape of erythrocytes. Therefore, conducting this experiment in patients with MDS may contribute to our understanding of the structure and morphology of dysplastic erythrocytes. Also, the Direct Coombs test can demonstrate the presence of antibodies or complement on the surface of erythrocytes, which may possibly indicate autoimmune manifestations in the peripheral blood of patients. In conclusion, the results of the study indicated the presence of anemia, leukopenia and thrombocytopenia in the patients, with a parallel increase in MCV, MCH, RDW, PDW and MPV and a decrease in MCHC index. Cryohemolysis results were almost identical in the patient and healthy people’s group, with those of the patients being slightly lower.