Ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένης με ανιχνευτή φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό επιλεγμένων φαινολικών ενώσεων που απαντώνται σε φυτικά εγχύματα
Development of a high-pressure liquid chromatography coupled with diode array detector method, for the determination of selected phenolic compounds found in herbal infusions
![Thumbnail](/xmlui/bitstream/handle/11400/5271/Karageorgiou_21014.pdf.jpg?sequence=6&isAllowed=y)
Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία
Author
Καραγεωργίου, Ελένη Μυρτώ
Date
2023-08-31Advisor
Στρατή, ΕιρήνηKeywords
Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ; Φαινολικά οξέα ; Χλωρογενικό οξύ ; Ροσμαρινικό οξύ ; Καφές ; Αρωματικά φυτά ; ΕγχύματαAbstract
Είναι ευρέως αποδεκτό πως ανάμεσα στις διάφορες τεχνικές διαχωρισμού, η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συγκαταλέγεται στις πιο αξιόπιστες τεχνικές ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης πολλών ενώσεων σε ένα μίγμα. Εκμεταλλευόμενη τις διαφορετικές χημικές ιδιότητες (π.χ μέγεθος, πολικότητα ή συγγένεια με τη στατική ή τη κινητή φάση) των προς ανάλυση ενώσεων, η HPLC είναι μια ιδανική τεχνική για τον διαχωρισμό μεγάλης ποικιλίας αναλυτών (π.χ. βιταμίνες, μυκοτοξίνες, βιοδραστικές ενώσεις κ.α). Παρόλα αυτά, ακόμη και στις περιπτώσεις που οι ενώσεις μιας μήτρας «μοιράζονται» παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες, χάρη στην υψηλή εκλεκτικότητα της, η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι σε θέση να διαχωρίσει τους αναλύτες διασφαλίζοντας μια ακριβή ανίχνευση και ποσοτικοποίηση.
Η ανάπτυξη της μεθόδου HPLC διαδραματίζει ένα από τους σημαντικότερους ρόλους για την αξιοποίηση των δυνατοτήτων της αλλά και την αντιμετώπιση των περιορισμών της. Τα βασικότερα βήματα τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη της μεθόδου είναι τα ακόλουθα: Πλήρης κατανόηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της προς ανάλυση μήτρας ή των προς ανάλυση ενώσεων, Επιλογή αρχικών χρωματογραφικών συνθηκών (επιλογή στήλης, τύπος έκλουσης, βελτιστοποίηση σύνθεσης κινητής φάσης, επιλογή ανιχνευτή), Προκατεργασία δείγματος, Βελτιστοποίηση της μεθόδου και τέλος Επικύρωση της μεθόδου. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης ήταν η ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένη με ανιχνευτή φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό επιλεγμένων ενώσεων όπως τα φαινολικά οξέα από δείγματα εγχυμάτων.
Τα φαινολικά οξέα είναι μη φλαβονοειδείς φαινολικές ενώσεις με κοινό χαρακτηριστικό τους την ύπαρξη τουλάχιστον μιας καρβοξυλομάδας στον δακτύλιο του βενζολίου. Από βιοσυνθετικής απόψεως, προέρχονται από δυο κύριες φαινολικές ενώσεις, το βενζοϊκό και το κινναμικό οξύ. Παραδείγματα υδροξυ-βενζοϊκών παραγώγων αποτελούν το γαλλικό οξύ, το p-υδροξυ- βενζοϊκό οξύ, το βανιλικό, το συριγγικό οξύ ενώ το καφεϊκό, το φερουλικό, το σιναπικό και το p-κουμαρικό ανήκουν στα υδροξυ-κινναμικά οξέα. Αξιοσημείωτη είναι και η μεγάλη ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει τα φαινολικά οξέα καθώς τη τελευταία δεκαετία έχουν αναφερθεί πάνω 30 διαφορετικά οξέα με έντονη βιολογική δράση, ενώ βρίσκονται σε αφθονία σε πάρα πολλά φρούτα, λαχανικά, αρωματικά φυτά αλλά και στον καφέ.
Συνολικά, η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν βαθμιδωτή χρησιμοποιώντας ως κινητή φάση ένα σύστημα μεθανόλης-νερού-οξικού οξέος 2% με ρυθμό ροής 1mL ανά λεπτό, εγχύοντας 20μL δείγματος και σαρώνοντας για 53 λεπτά στα 280nm. Με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε προσδιορίστηκαν ταυτόχρονα 16 φαινολικά οξέα, ενώ η εφαρμογή της μεθόδου σε επιλεγμένα δείγματα καφέ και παραπροϊόντων αρωματικών φυτών όπως η ρίγανη, τα ρόδα και η λεβάντα φανέρωσε αξιοσημείωτες μεταβολές στο φαινολικό προφίλ. Πιο συγκεκριμένα, στο χλωρογενικό οξύ το οποίο βρίσκεται στη μεγαλύτερη αφθονία στον καφέ παρατηρήθηκε μείωση (από 6mg ανα g ξηρού δείγματος σε 0.5mg ανά g ξηρού δείγματος) ανάλογη με την ένταση του καβουρδίσματος. Όσον αφορά στα παραπροϊόντα αρωματικών φυτών, ανιχνεύθηκαν σε όλα ροσμαρινικό οξύ και 4-υδροξυ βενζοϊκό οξύ. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα δείγματα καφέδων, το προφίλ φαινολικών οξέων στα παραπροϊόντα χαρακτηρίστηκε από σημαντικές διακυμάνσεις οι οποίες πιθανόν να οφείλονται σε διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας και διαχείρισης. Η παρούσα μέθοδος μπορεί να βρει εφαρμογή στην ανάλυση τροφίμων ενώ με την επικύρωση της, την διεύρυνση του πεδίου εφαρμογής της και τον εμπλουτισμό των ενώσεων που μπορούν να προσδιοριστούν με αυτή μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο και αξιόπιστο αναλυτικό εργαλείο.
Abstract
It is widely accepted that among the separation methodologies, high- performance liquid chromatography is among the most reliable techniques for the detection and quantification of various compounds in a complex mixture. Taking advantage of chemical characteristics (polarity, affinity with stationary or mobile phase) of the analytes, HPLC offers the simultaneous determination of the studied compounds. Nevertheless, even in cases that the compounds of a given matrix “share” same chemical characteristics, thanks to its high selectivity, HPLC is able to separate them ensuring an accurate detection and quantification.
Meanwhile, the development of the HPLC method plays on of the most important roles in exploiting its potential but also addressing its limitations. The main steps involved in the development of such a method are: (a) complete understanding of the physicochemical properties of the matrix to be analyzed or the compounds to be analyzed, (b) selection of initial chromatographic conditions (column selection, elution type, composition of the mobile phase), (c) pre-treatment of sample, (d) optimization of the method and (e) validation of the developed method. The aim of this post-graduate study was to develop such an HPLC-DAD method for the determination of selected compounds such as phenolic acids from herbal infusions.
Phenolic acids are non-flavonoid phenolic compounds with a common characteristic of having at least one carboxyl group on the benzene ring. From a biosynthetic point of view, they are derived from two main phenolic compounds known as benzoic and cinnamic acid, while they are found in abundance in many fruits, vegetables, aromatic plants as well as coffee. Example of hydroxy-benzoic derivatives are gallic acid, p-hydroxy benzoic acid, vanillic acid, syringic acid while caffeic acid, ferulic acid, sinapic and p-coumaric belong to hydroxy-cinnamic acids. The great diversity that characterizes phenolic acids is also noteworthy, since over 30 different acids (with intense biological activity) have been reported in the last decade.
Overall, the developed method was stepwise using methanol-water-acetic acid 2% as mobile phase at a flow rate of 1mL per minute, injecting 20 microliters of sample and scanning for 53 in total at 280nm. The present method allows the simultaneous determination of 16 phenolic acids, while the application of the method to selected samples of coffee and by-products of aromatics plants (oregano, rose, lavender) revealed remarkable changes in the phenolic profile. More specifically, chlorogenic acid, which was found to in greater abundance in most of the coffee samples, decreased (from 6mg per gr of dry sample to <1.0mg per gr dry sample) in proportion to the intensity of roasting (light- medium-dark). Regarding by-products of aromatic plants phenolic profile was dominated by rosmarinic and p-hydroxy benzoic acids.
However, in contrast to the coffee samples, the phenolic acid profile in the by-products was characterized by significant variations which may be related with the different processing and handling conditions. The present method can be applied in the sector of food analysis, while its validation as well as expansion of use by enriching the compound to be analyzed or type of samples, can transform it into a very useful and reliable analytical tool.