Δομική ανάλυση και υπολογιστική στόχευση του υποδοχέα ορμόνης απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης με δυνητικά βιοδραστικά μόρια

Τσιανάκας, Κωνσταντίνος

Structural analysis and computational targeting of growth hormone releasing hormone receptor with potential bioactive molecules

Διπλωματική εργασία

Author

Τσιανάκας, Κωνσταντίνος

Date

2023-10-11

Advisor

Matsoukas, Minos-Timotheos

Διπλωματική εργασία (5.031Mb)

Keywords

GPCRs ; GHRH-R ; GHRH ; Κρύο-ηλεκτρονική μικροσκοπία ; Μοριακή πρόσδεση ; Μοριακοί περιγραφείς ; Μοριακά αποτυπώματα ; Συντελεστής Tanimoto ; Χημειοθήκες ; Εικονική σάρωση

Abstract

Η ορμόνη απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone Releasing Hormone, GHRH) είναι ένα νευροπεπτίδιο που αποτελείται από 44 αμινοξέα και παράγεται στον υποθάλαμο. Μετά την σύνθεση της απελευθερώνεται και οδηγείται προς τα σωματοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης όπου προσδένεται με τον υποδοχέα ορμόνης απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone Releasing Hormone Receptor, GHRH-R) διεγείροντας την σύνθεση της αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone, GH). Ο GHRH-R ανήκει στην Β οικογένεια των υποδοχέων συζευγμένων με G πρωτεΐνη (G-Proteins Coupled Receptors, GPCRs) και συγκεκριμένα στην Β1 υποκατηγορία των υποδοχέων σεκρετίνης. Σε περιπτώσεις σοβαρών διαταραχών συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, του μαστού, των ωοθηκών και του προστάτη, ο GHRH-R υπερεκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα καθιστώντας τον έναν πολύ σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η δομική ανάλυση του GHRH-R και η στόχευση του με μικρά μη πεπτιδικά μόρια. Αρχικά γίνεται η δομική ανάλυση του GHRH-R μέσω της μελέτης των αλληλεπιδράσεων που κάνει με το ενδογενές του πεπτίδιο. Έπειτα αναλύεται μια σειρά βιοδραστικών ενώσεων με την ένδειξη “MK”, που έχουν δοκιμαστεί πειραματικά και προέρχονται από δουλειά που έχει προηγηθεί. Στόχος είναι η μελέτη του μηχανισμού πρόσδεσης των ενώσεων στον υποδοχέα. Τέλος εφαρμόζεται η υπολογιστική τεχνική της εικονικής σάρωσης με σκοπό τον εντοπισμό δυνητικά βιοδραστικών μορίων με ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R. Για την αξιολόγηση της σειράς των βιοδραστικών ενώσεων MK που έχουν δοκιμαστεί πειραματικά εφαρμόστηκε η υπολογιστική τεχνική της μοριακής πρόσδεσης. Για την επιτυχημένη εφαρμογή της μεθόδου απαιτείται μια σειρά από διαδικασίες όπως είναι η προετοιμασία της πρωτεΐνης-στόχου, των προσδετών καθώς και η ρύθμιση ενός συνόλου παραμέτρων. Η μοριακή πρόσδεση έλαβε μέρος στην ορθοστερική θέση της διαμεμβρανικής περιοχής του υποδοχέα τόσο για την ενεργή όσο και την ανενεργή του κατάσταση. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με βάση το σκορ πρόσδεσης αλλά και μέσω των αλληλεπιδράσεων που σχηματίστηκαν μεταξύ των προσδετών και του GHRH-R. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στις ενώσεις που παρουσίασαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα κατά την πειραματική τους δοκιμή. Συγκεκριμένα ξεχώρισε για την αγωνιστική της δράση η ένωση MK24 ενώ για την ανταγωνιστική της δράση η MK04 και οι παρόμοιες με αυτή MK04-6 και MK04-9. Τα υπολογιστικά αποτελέσματα που προέκυψαν ποικίλουν. Ειδικότερα το σκορ πρόσδεσης της ένωσης MK24 δεν αντικατοπτρίζει τα πειραματικά αποτελέσματα. Από την άλλη αλληλεπιδρά με συγκεκριμένα αμινοξέα του υποδοχέα που συμμετέχουν και κατά την διαδικασία σχηματισμού του συμπλόκου GHRHR – GHRH και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγωνιστική δράση της ένωσης MK24. Η σειρά των ενώσεων με ανταγωνιστική δράση MK04, MK04-6 και MK04-9 σημείωσε καλό σκορ πρόσδεσης. Κατά την ανάλυση των αλληλεπιδράσεων τους, παρατηρήθηκε πως οι τρείς ενώσεις έχουν παρόμοιο τρόπο δέσμευσης όμως οι μικρές δομικές διαφορές τους συντελούν σε μοναδικές αλληλεπιδράσεις με τον υποδοχέα. Γενικότερα και οι τρείς ενώσεις αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένα αμινοξέα του υποδοχέα που επιβεβαιώνουν εν μέρη τα πειραματικά αποτελέσματα και την ανταγωνιστική τους δράση. Στην συνέχεια με σκοπό την ανακάλυψη δυνητικά βιοδραστικών μορίων με ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R εφαρμόστηκε η εικονική σάρωση. Χρησιμοποιήθηκαν δύο χημειοθήκες με 14.511 βιοδραστικές ενώσεις συνολικά οι οποίες αντλήθηκαν ηλεκτρονικά και ακολούθησε η προ-επεξεργασία τους. Αφού πρώτα οι ενώσεις φιλτραρίστηκαν με βάση τον κανόνα των πέντε του Lipinski και προετοιμάστηκαν, ακολούθησε η εφαρμογή της μοριακής πρόσδεσης. Με βάση το σκορ πρόσδεσης ξεχώρισαν οι καλύτερες ενώσεις. Στις ενώσεις αυτές εφαρμόστηκε ο συντελεστής Tanimoto και ξεχώρισαν εκείνες με το χαμηλότερο ποσοστό ομοιότητας που κωδικοποιήθηκαν με τα μοριακά αποτυπώματα RDKit. Ακολούθησε η αξιολόγηση των ενώσεων από την οποία προέκυψαν οι τελικές ενώσεις με πιθανή ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R. Μάλιστα από αυτές ξεχώρισε μια ένωση που συνδύαζε καλό σκορ πρόσδεσης και αλληλεπιδράσεις με σημαντικά αμινοξέα του υποδοχέα.

Abstract

Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) is a neuropeptide consisting of 44 amino acids and produced in hypothalamus. After its synthesis, it is released and directed to the somatotropic cells of the pituitary gland where it binds to the Growth Hormone Releasing Hormone Receptor (GHRH-R) stimulating the synthesis of Growth Hormone (GH). GHRH-R belongs to the B family of G-Proteins Coupled Receptors (GPCRs) and specifically in the B1 subclass of secretin receptors. In cases of severe disorders, including pancreatic, breast, ovarian and prostate cancer, GHRH-R is overexpressed in cancer cells, making it a significant therapeutic target. The aim of this study is the structural analysis of GHRH-R and its targeting with small non-peptide molecules. Initially, the structural analysis of GHRH-R is conducted by examining its interactions with its endogenous peptide. Subsequently, a series of bioactive compounds labeled as “MK”, which have been experimentally tested and derived from previous research, are analyzed. The purpose is to study the mechanism of binding of these compounds to the receptor. Finally, the computational technique of virtual screening is applied to identify potential bioactive molecules with competitive action against GHRH-R. For the evaluation of the series of bioactive compounds MK that have been experimentally tested, the computational technique of molecular docking was applied. Successful application of the method requires a series of procedures such as the preparation of the protein target, the ligands and the adjustment of a set of parameters. Molecular docking took place in the orthosteric binding site of the transmembrane region of the receptor for both its active and inactive states. The results were assessed based on the docking score and the interactions formed between the ligands and GHRH-R. Special attention was given to compounds that exhibited encouraging results during their experimental testing. Specifically, the compound MK24 stood out for its agonistic action, while MK04 and its analogs MK04-6 and MK04-9, demonstrated competitive action. Computational results varied. Particularly the docking score of compound MK24 did not reflect the experimental outcomes. On the other hand, it interacted with specific amino acids of the receptor involved in the formation of the GHRHR-GHRH complex, indicating a significant role in the agonistic action of MK24. The series of compounds with antagonistic action, MK04, MK04-6 and MK04-9 achieved a good docking score. In the analysis of their interactions, it was observed that all three compounds had a similar binding mode, yet their small structural differences led to unique interactions with the receptor. Overall, all three compounds interacted with specific amino acids of the receptor, partially confirming the experimental results and their competitive action. Next, with the aim of discovering potential bioactive molecules with competitive action against GHRH-R, virtual screening was implemented. Two chemical libraries with a total of 14.511 bioactive compounds were utilized, electronically retrieved and subjected to pre-processing. After the compounds were filtered based on the Lipinski’s rule of five and prepared, molecular docking was applied. The best compounds were distinguished based on the docking score. The Tanimoto coefficient was applied to these compounds, highlighting those with the lowest similarity percentage encoded with RDKit molecular fingerprints. The evaluation of the compounds followed, from which the final compounds with potential competitive action against GHRH-R emerged. Notably, among these a compound stood out combining a good docking score and interactions with significant amino acids of the receptor.