Συνδυασμός ανοσοϊστοχημικών και ιστοχημικών τεχνικών σε δείγματα ιστών εγκλεισμένων σε παραφίνη για τον συν-εντοπισμό πρωτεϊνών των κυττάρων και του μικροπεριβάλλοντος.

Μπόγρη, Όλγα

Combination of immunohistochemical and histochemical techniques on paraffin embedded tissues for the co-localization of cellular and microenvironmental proteins.

Πτυχιακή εργασία

Author

Μπόγρη, Όλγα

Date

2024-03-05

Advisor

Παπαναστασίου, Αναστάσιος

Πτυχιακή εργασία (6.186Mb)

Keywords

Ανοσοϊστοχημεία ; Ιστοχημεία ; Παθολογική Ανατομική ; Ki67 ; Ανιλίνη ; Τριπλή Χρώση

Abstract

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Ο όρος παθολογική ανατομική αναφέρεται στην ειδικότητα της ιατρικής που μελετά την παθοφυσιολογία της νόσου. Ειδικότερα μελετώνται τα κύτταρα και οι ιστοί, καθώς η νόσος ξεκινά στο κυτταρικό επίπεδο, ωστόσο οι κυτταρικές διαταραχές προέρχονται από μεταβολές σε άλλα μόρια όπως οι πρωτεΐνες, οι οποίες επηρεάζουν την επιβίωση και τη βιολογική συμπεριφορά των κυττάρων. Στην καθ’ημέρα πράξη, στο εργαστήριο παθολογικής ανατομικής η κύρια χρώση που χρησιμοποιείται είναι αυτή της αιματοξυλίνης/ηωσίνης ενώ εφαρμόζονται και άλλες χρώσεις για τη διερεύνηση άλλων συστατικών του κυττάρου, όπως η χρώση της ανιλίνης που χρησιμοποιείται για την ανάδειξη του κολλαγόνου των ιστών το οποίο συμμετέχει στην εξέλιξη πολλών νόσων. Παράλληλα η ανοσοϊστοχημεία αναγνωρίζεται ως μια τεχνική που στηρίζεται στην αλληλεπίδραση αντιγόνου και αντισώματος με σκοπό τον εντοπισμό και την ανάδειξη ειδικών αντιγόνων εντός των κυττάρων και των ιστών. Επιπλέον η εφαρμογή αυτής της τεχνικής συμβάλλει στην ταξινόμηση των νεολασμάτων και στην ταυτοποίηση της προέλευσης ενός μεταστατικού όγκου. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτελεί η ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου συνδυασμού των δύο βασικών τεχνικών του παθολογοανατομικού εργαστηρίου: Της Διπλής Ανοσοϊστοχημικής χρώσης που στοχεύει στον εντοπισμό δύο αντιγονικών επιτόπων και της Ιστοχημικής χρώσης της Ανιλίνης για την ανάδειξη του κολλαγόνου. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Για τη διεξαγωγή της μελέτης χρησιμοποιήθηκε ιστός από μασχαλιαίο λεμφαδένα, εγκλεισμένος σε παραφίνη, ο οποίος παρουσίαζε μεταστατική εστία από καρκίνωμα μαστού. Η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκε μέσω της χρήσης ειδικών αντισωμάτων έναντι της πυρηνικής πρωτεΐνης Ki-67 και της διαμεμβρανικής γλυκοπρωτεΐνης CD8 και συνδυάστηκε με την ιστοχημική χρώση της ανιλίνης. Έπειτα πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων που αποσκοπούσαν στην αναζήτηση των βέλτιστων συνθηκών για το συνδυασμό των δύο αυτών τεχνικών. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Πραγματοποιήθηκαν πέντε τροποποιήσεις στο βασικό πρωτόκολλο, οι οποίες οδήγησαν στην τελική μορφή του. Μια από αυτές τις τροποποιήσεις λειτούργησε ως μέθοδος επιβεβαίωσης της παρουσίας κολλαγόνου. Οι διάφορες παραλλαγές πραγματοποιήθηκαν αποσκοπώντας η τελική πειραματική διαδικασία να αναδεικνύει με τον βέλτιστο τρόπο ταυτόχρονα τις πρωτεΐνες ki67, CD8 και το κολλαγόνο, τόσο μέσα στα κύτταρα όσο και στο μικροπεριβάλλον του ιστού. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Μετά από μια σειρά πειραμάτων που ως στόχο είχαν την επανεξέταση και τη βελτίωση των συνθηκών για τον συνδυασμό των δύο μεθόδων (ανοσοϊστοχημείας και ιστοχημείας) χαρακτηρίστηκε το τελικό πρωτόκολλο που παρέχει σαφή αποτελέσματα όσον αφορά τη μέθοδο της διπλής ανοσοϊστοχημείας Ki67-CD8 σε συνδυασμό με τη χρώση ανιλίνης. Η τεχνική αυτή μπορεί να εφαρμοστεί στο μέλλον ευρύτερα και σε διάφορες παθολογικές οντότητες που παρουσιάζουν ίνωση.

Abstract

INTRODUCTION: Surgical Pathology refers to the specialty of medicine that studies the pathophysiology of human disease. More specifically, cells and tissue are studied as the disease starts at the cellular level. However, cellular disorders come from changes in molecules such as proteins, which affect the survival and biological behavior of cells. In the pathology laboratory the main staining used is hematoxylin/eosin, while other histochemical stainings are also used to investigate other cell components, such as the aniline staining which is used to highlight the tissue collagen that participates in the development of many diseases. At the same time immunohistochemistry is recognized as a technique based on the antigen-antibody interaction in order to identify specific proteins within cells and tissues. Furthermore, the application of this technique contributes to the classification of neoplasms and to the identification of the origin of a metastatic tumor. The aim of this thesis is to study the combination of the two basic techniques of the pathology laboratory on the same tissue sample: Double immunohistochemical staining and Aniline histochemical staining. The first one allows the detection of two different antigenic epitopes, while the second is used to detect collagen at the same time. MATERIALS AND METHODS: For the fulfilment of this study, FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) tissue from an axillary lymph node was used, which presented a metastatic focus from a breast carcinoma. The technique of immunohistochemistry was performed through the use of specific antibodies against the nuclear protein Ki-67 and the transmembrane glycoprotein CD8 and was combined with the histochemical staining for aniline. Then, a series of refinement experiments were carried out aimed at defining the optimal conditions for the combination of these two techniques. RESULTS: Five modifications were carried out to the basic protocol, leading to its final form. One of these modifications worked as a method of confirming the presence of collagen. The various variations were performed in order that the final experimental procedure would optimally highlight the Ki67, CD8 and collagen simultaneously, both inside the cells and in the tissue microenvironment. CONCLUSIONS: After a series of experiments that aimed at reviewing and improving the conditions for the combination of the two methods (immunohistochemistry and histochemistry) the final protocol was characterized that provides clear results regarding the double immunohistochemistry method Ki67-CD8 in combination with the histochemistry staining of aniline. This technique can be applied in the future more widely and in various pathological conditions that show fibrosis.