Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την ταχεία ανίχνευση της μετάλλαξης M184V του ιού HIV-1

Μαρίνου, Μαρία

Development of a protocol for the rapid detection of the M184V mutation of HIV-1

Πτυχιακή εργασία

Author

Μαρίνου, Μαρία

Date

2024-10

Advisor

Kolliopoulou, Anna

MARINOU_19678169.pdf (3.416Mb)

Keywords

HIV-1 ; Μεταλλάξεις ; M184V ; HRMA ; RFLPs ; Ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας ; Αντιρετροϊκή θεραπεία ; Ανάλυση τήξης υψηλής ευκρίνειας ; Περιοριστικά ένζυμα ; Πολυμορφισμοί μήκους θραυσμάτων περιορισμού

Abstract

Η λοίμωξη με τον ιό HIV απουσία θεραπείας μπορεί να εξελιχθεί στο Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας (AIDS). Αν και η αντιρετροϊκή θεραπεία (ART) καθιστά τη λοίμωξη HIV μια χρόνια διαχειρίσιμη κατάσταση, η εκτεταμένη μεταλλακτικότητα του HIV εμποδίζει την αποτελεσματικότητα της ART, καθιστώντας τα άτομα ευάλωτα σε ευκαιριακές λοιμώξεις και σε διαφόρους τύπους καρκίνου. Η μετάλλαξη M184V ανιχνεύεται στο κωδικόνιο 184 (αντιστοιχεί στην αντίστροφη μεταγραφάση -RT- του ιού), ευθύνεται για τη μετατροπή μιας μεθειονίνης (ATG) σε βαλίνη (GTG), και εμφανίζεται σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπευτικά σχήματα με NRTIs προκαλώντας υψηλού επιπέδου αντοχή στους αναστολείς RT λαμιβουδίνη και εμτρισιταβίνη. Στην παρούσα εργασία RNA το οποίο είχε απομονωθεί από δείγματα ατόμων θετικών στον ιό HIV υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή, και το cDNA που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για 2 διαδοχικές αντιδράσεις nested PCR (τελικό προϊόν 485bp). Ακολούθως, εφαρμόστηκαν 2 παράλληλες στρατηγικές για την ταχεία ανίχνευση της M184V: α) Με χρήση της τεχνικής των RFLPs (Πολυμορφισμοί Μήκους Θραυσμάτων Περιορισμού - Restriction Fragment Length Polymorphisms), επιλέχθηκαν περιοριστικά ένζυμα που αναγνωρίζουν και κόβουν επιλεκτικά μόνο τη μεταλλαγμένη ή την αγρίου τύπου αλληλουχία. Μετά από πέψη για κάθε δείγμα σε ξεχωριστές αντιδράσεις και με τις 2 κατηγορίες ενζύμων, τα θραύσματα DNA ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης και σύμφωνα με το πρότυπο ζώνωσης που προέκυψε, ταυτοποιήθηκε η ύπαρξη ή όχι της μετάλλαξης β) Με χρήση της τεχνικής HRMA (Ανάλυση Τήξης Υψηλής Ευκρίνειας - High Resolution Melting Analysis), σε ασύμμετρη qPCR χρησιμοποιήθηκαν, πέραν του ειδικά σχεδιασμένου ζεύγους εκκινητών F και R (προϊόν 81bp), εναλλακτικά για κάθε δείγμα σε ξεχωριστές αντιδράσεις 3’-φωσφορυλιωμένοι ανιχνευτές που λειτουργούν επίσης ως εκκινητές R, οι οποίοι προσδένονται στη μεταλλαγμένη ή την αγρίου τύπου αλληλουχία (προϊόν 42bp). Τα 2 προϊόντα που προκύπτουν έχουν διαφορετικές Tm, που παρατηρούνται στις καμπύλες αποδιάταξης στο τέλος κάθε αντίδρασης. Η ύπαρξη ή όχι κορυφής στη συγκεκριμένη Tm υποδηλώνει την ύπαρξη ή όχι της μετάλλαξης.

Abstract

HIV infection, in the absence of treatment, can lead to Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS). Although antiretroviral therapy (ART) makes HIV infection a manageable chronic condition, the extensive mutagenicity of HIV inhibits the effectiveness of ART, leaving individuals vulnerable to opportunistic infections and various cancer types. The M184V mutation is detected in codon 184 (belongs to the reverse transcriptase -RT- of the virus), is responsible for the conversion of methionine (ATG) to valine (GTG), and occurs in patients receiving treatment with NRTIs, causing high resistance to the RT inhibitors lamivudine and emtricitabine. In the present work, RNA isolated from HIV-positive samples was subjected to reverse transcription, and the resulting cDNA was then used as template for 2 consecutive nested PCR reactions (final product size 485bp). Subsequently, 2 parallel strategies were applied for the rapid detection of M184V: a) By use of the Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) technique, restriction enzymes were selected that recognize and selectively cut only the mutant or wildtype sequence. After digestion of each sample in separate reactions with both the 2 classes of enzymes, the DNA fragments were subjected to agarose gel electrophoresis and, according to the resulting banding pattern, the presence or absence of the mutation was identified. b) By use of the High-Resolution Melting Analysis (HRMA) technique, in asymmetric qPCR, in addition to specially designed primer pair F and R (product size 81bp), 3'- phosphorylated probes that also function as R primers were used alternatively for each sample in separate reactions, which bind to the mutant or wild-type sequence (product size 42bp). The 2 resulting products have different Tms, which can be observed in the dissociation curves at the end of each reaction. The presence or absence of a peak at the particular Tm indicates the presence or absence of the mutation.