Ανάπτυξη in-house πειραματικού πρωτοκόλλου για την αλληλούχηση του γονιδίου της Ιντεγκράσης του Ιού HIV-1 και την ανίχνευση πολυμορφισμών που μπορεί να σχετίζονται και με την ανάπτυξη αντοχής σε αντιρετροϊκή θεραπεία

Abstract

Εισαγωγή: Τα άτομα που έχουν μολυνθεί με τον ιό HIV έχουν πάψει πλέον να χαρακτηρίζονται ως φορείς ή ασθενείς της HIV λοίμωξης και αποκαλούνται άτομα που ζουν με τον ιό, καθώς η αντιρετροϊκή θεραπεία καταστέλλει πλήρως τον ιικό πολλαπλασιασμό. Η αντιρετροϊκή θεραπεία στοχεύει κατά βάση στην αναστολή της λειτουργίας τριών ιικών γονιδίων, της πρωτεάσης, της αντίστροφης μεταγραφάσης και της ιντεγκράσης. Παρόλα αυτά, ορισμένα στελέχη του ιού HIV φέρουν μεταλλάξεις, οι οποίες προσδίδουν αντοχή έναντι της αντιρετροϊκής θεραπείας, ο επιπολασμός της οποίας έχει εκτιμηθεί σε ποσοστό 7% στην Ευρώπη, 17% στη Βόρια Αμερική, και 5,3% στην Ελλάδα . Σκοπός: Αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ένα in-house πειραματικό πρωτόκολλο για την εύρεση μεταλλάξεων που προσδίδουν αντοχή έναντι των αντιρετροϊκών φαρμάκων που στοχεύουν το γονίδιο της ιικής ιντεγκράσης. Μέθοδος: Το πρωτόκολλο περιλαμβάνει: α) απομόνωση ιικού RNA από ορό δείγματος, β) δημιουργία μονόκλωνου συμπληρωματικού cDNA και στη συνέχεια δίκλωνου DNA με PCR αντίστροφης μεταγραφής ενός βήματος, γ) ενίσχυση με φωλεακή και ειδικότερη PCR ενός μικρότερου τμήματος του γονιδίου της ιντεγκράσης, δ) καθαρισμός του παραγόμενου DNA, ε) προετοιμασία για αλληλούχηση κατά Sanger, στ) ανάλυση χρωματογραφημάτων αλληλούχησης με το λογισμικό SeqScape™ Software, και ζ) επεξεργασία σε βάσεις δεδομένων (HIV Drug Resistance Database, REGA HIV Subtyping Tool, Comet HIV-1) για την εύρεση μεταλλάξεων και γονοτύπων. Αποτελέσματα: Ύστερα από την αλληλούχηση κατά Sanger 40 δειγμάτων ατόμων που ζουν με HIV λοίμωξη, 2 εμφάνισαν μεταλλάξεις αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης (5%), οι οποίες προσέδιδαν στην πρώτη περίπτωση υψηλού επιπέδου αντοχή στα αντιρετροϊκά BIC, CAB, DTG, EVG, RAL και στη δεύτερη περίπτωση υψηλού επιπέδου αντοχή στους αναστολείς EVG, RAL και χαμηλού επιπέδου στους BIC, CAB, DTG. Από τα 40 δείγματα, 22 εμφάνισαν μεταλλάξεις πολυμορφισμού (55%), εκ των οποίων 12 έφεραν τη μετάλλαξη Μ50Ι (55%), 6 τη μετάλλαξη L74I (27%), 3 τη μετάλλαξη L74M (13%), και 1 έφερε τις μεταλλάξεις L74I και τη V151I (5%). Σχετικά με τη γονοτύπηση των δειγμάτων το 55% είναι γονότυπου G, το 27,5% γονότυπου Α, 10% γονότυπου Β, και 7,5% είναι ανασυνδυασμένοι γονότυποι (CRFs). Συμπεράσματα: Το in-house πειραματικό πρωτόκολλο, το οποίο αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε, ενδείκνυται για εύρεση μεταλλάξεων αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης. Εξαιτίας του μικρού αριθμού δειγμάτων δεν μπορεί να αχθεί συνολικό συμπέρασμα για τον επιπολασμό των μεταλλάξεων αντοχής στον ελληνικό πληθυσμό. Είναι αναγκαίο να πραγματοποιηθούν περισσότερες μελέτες για τις μεταλλάξεις αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης σε εγχώρια αλλά και σε παγκόσμια κλίμακα.