Ορολογική διερεύνηση των Φυσικών Αντισωμάτων σε πουλερικά, εκτρεφόμενα υπό διαφορετικές βιομηχανικές συνθήκες.

Abstract

Tα Φυσικά Αντισώματα (ΦΑ) ανευρίσκονται στον ορό υγιών ατόμων χωρίς προηγούμενη εμφανή ανοσοποίηση και λειτουργούν ως πρώτη γραμμή άμυνας έναντι παθογόνων, συμμετέχοντας στη διατήρηση της ομοιόστασης του ανοσιακού συστήματος. Τα ΦΑ έχουν ανιχνευθεί σε όλα τα είδη των σπονδυλωτών που έχουν ως τώρα μελετηθεί. Αποτελούν ιδιαίτερα σημαντικούς παράγοντες τόσο στην έμφυτη όσο και στην επίκτητη ανοσία, η κωδικοποίησή τους γίνεται από γονίδια της βλαστικής σειράς και ανήκουν στις τάξεις M, G, A και E των ανοσοσφαιρινών. Ειδικότερα, στα θηλαστικά, τα ΦΑ είναι ως επί το πλείστον τάξης IgM και μπορούν να συνδεθούν με εαυτά και ξένα αντιγόνα (πχ. παθογόνο) χωρίς ο οργανισμός να έχει εκτεθεί σε αυτά. Τέλος, τα ΦΑ παρουσιάζουν ένα ιδιαίτερα σημαντικό χαρακτηριστικό, την πολυδραστικότητα, δηλαδή την ικανότητα να αναγνωρίζουν πολλά αντιγόνα διαφορετικής σύστασης και δομής, η οποία συνδέεται άμεσα με τις διάφορες ευεργετικές δράσεις /λειτουργίες τους. Στην αγροδιατροφή, το πιο ταχέως αναπτυσσόμενο ζωικό παραγωγικό σύστημα είναι τα πουλερικά και ειδικότερα τα κοτόπουλα κρεοπαραγωγής. Ωστόσο, υπάρχει η συνεχής ανάγκη αξιολόγησης των επιζήμιων επιπτώσεων της εντατικής παραγωγής στην ασφάλεια των τροφίμων και στην καλή διαβίωση και ευζωία των ζώων. Στην προσπάθεια αναζήτησης κατάλληλων βιολογικών δεικτών έχουν αναζητηθεί ΦΑ κατά κύριο λόγο από την ομάδα του Parmentier στην Ολλανδία, σε ορούς κοτόπουλων, ψαριών, αγελάδων και άλλων ειδών. Η παρουσία ΦΑ σε ορούς κοτόπουλου έχει κυρίως περιγραφεί χρησιμοποιώντας μία μεταλλοπρωτεΐνη (Keyhole Limpet Hemocyanin/ KLH), η οποία χρησιμοποιήθηκε ως μη- εαυτό/ «ξένο» αντιγόνο, καθώς οι οργανισμοί φυσιολογικά δεν εκτίθενται σε αυτό. Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου Ανοσολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ και στο πλαίσιο βιομηχανικής έρευνας, είχαν διερευνηθεί σε ορούς κοτόπουλων (n=555), εκτρεφόμενων υπό διαφορετικές συνθήκες, τα επίπεδα κυκλοφορούντων ΦΑ τάξης IgM και IgY έναντι εαυτών (DNA και Ακτίνη/ACT) και μη-εαυτών (Tρινιτροφαινόλη/ΤNP και Λιποπολυσακχαρίτης/LPS) αντιγόνων. Οι δύο ομάδες των κοτόπουλων που μελετήθηκαν ήταν αφενός αργής ανάπτυξης (ελευθέρας βοσκής/ΕΒ) με γονότυπο Sasso και αφετέρου ταχείας ανάπτυξης (συμβατικής εκτροφής/ΣΕ) με γονότυπο Ross 308. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε με βάση την αιμοληψία κατά την τελευταία ημέρα ζωής των κοτόπουλων των δύο ομάδων, η οποία διαφέρει μεταξύ τους καθώς για τα κοτόπουλα ΣΕ είναι στις 47 ημέρες, ενώ για τα κοτόπουλα ΕΒ στις 67. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τα επίπεδα των ΦΑ IgM έναντι όλων των επιλεγμένων αντιγόνων ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κοτόπουλα ΕΒ σε σύγκριση με κοτόπουλα ΣΕ. Επιπλέον, τα επίπεδα των ΦΑ IgY έναντι του DNA ήταν υψηλότερα στα ΣΕ σε σύγκριση με τα ΕΒ (p<0.001), ενώ το αντίθετο ίσχυε για τα επίπεδα των ΦΑ IgY έναντι του LPS (p<0.01). Η πτυχιακή αυτή αποτελεί συνέχεια της προηγούμενης έρευνας του εργαστηρίου και είχε σαν στόχο, αρχικά, τον έλεγχο των ΙgΜ και IgY ΦΑ των ορών κοτόπουλων στην ίδια ημέρα ανάπτυξης-αιμοληψίας (47 ημερών) καθώς και τη συσχέτισή τους με τις ολικές IgM και IgY του ορού. Επιπλέον η μελέτη στόχευε στον έλεγχο της επίδρασης αποδιατακτικών παραγόντων στη δραστικότητα των IgY ΦΑ του ορού, με δύο τρόπους, α) θερμική μετουσίωση των πρωτεϊνών στους 56οC και β) προσθήκη διαλύματος ουρίας 6Μ, για την ανάδειξη πιθανών «κρυμμένων» δραστικοτήτων των ΦΑ ορού. Έτσι, μελετήθηκε η δραστικότητα (αντισωματική δράση) των IgM και IgY ΦΑ ορού σε σύγκριση με την ολική ποσότητα των IgM και IgY ορού με έμμεση- και sandwich- ELISA, αντίστοιχα. Η κάθε ομάδα κοτόπουλων (ΣΕ & ΕΒ) αποτελείται από κοτόπουλα που συλλέχθηκαν από 3 ανεξάρτητα κοπάδια, όπου από το κάθε ένα αναλύθηκαν 16 κοτόπουλα (48 σύνολο η κάθε ομάδα). Επειδή όμως θέλαμε να επιβεβαιώσουμε πως οι διαφορές μεταξύ των ομάδων σχετίζονται με τον γονότυπο κι όχι με την ηλικία, η δειγματοληψία έγινε για τις δύο ομάδες στις 47 ημέρες (n=96), αλλά για τα ΕΒ και στις 67 (n=48). Από τα αποτελέσματα της έρευνάς μας, φάνηκε πως : α) τα κυκλοφορούντα επίπεδα των IgM ΦΑ έναντι όλων των επιλεγμένων αντιγόνων (DNA, ACT, LPS, TNP) ήταν υψηλότερα στους ορούς των κοτόπουλων ΕΒ σε σύγκριση με τα ΣΕ στην ίδια ηλικία (47 ημερών), β) οι ίδιες διαφορές ισχύουν και όσον αφορά τη συγκέντρωση της ολικής IgM ορού μεταξύ των δύο ομάδων. Ωστόσο, μετά από κανονικοποίηση των τιμών, τα επίπεδα IgM ΦΑ παραμένουν υψηλότερα για τα ΕΒ. Γίνεται έτσι αντιληπτό πως οι διαφοροποιήσεις μεταξύ των δύο ομάδων ως προς τα επίπεδα των IgM ΦΑ και της ολικής IgM, αποτελούν χαρακτηριστικό των γονότυπων κι όχι της ηλικίας. γ) ομοίως, τα κυκλοφορούντα επίπεδα των IgY ΦΑ έναντι του DNA ήταν υψηλότερα για τα ΣΕ, σε σχέση με τα ΕΒ στην ίδια ηλικία (47 ημερών), ενώ το αντίθετο ισχύει για τις δύο ομάδες έναντι των αντιγόνων LPS και TNP. δ) δεν παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στις συγκεντρώσεις των ολικών IgY του ορού μεταξύ των ομάδων, κάτι που δείχνει πως οι παραπάνω διαφορές στα επίπεδα αποτελούν ποιοτικά κι όχι ποσοτικά χαρακτηριστικά των IgY. ε) η υποβολή των ορών στα αποδιατακτικά μέσα έδειξε Α) : την ισχυρή συγγένεια που εμφάνισαν τα IgY ΦΑ των ΕΒ με τα αντιγόνα ACT και LPS, και ομοίως των ΣΕ με το αντιγόνο DNA (διάλυμα ουρίας 6Μ), και Β) την ύπαρξη «κρυμμένων» δραστικοτήτων των ορών ως προς τα IgY ΦΑ με υψηλότερες τιμές να εμφανίζονται στα επίπεδα των ΕΒ έναντι των αντιγόνων DNA, LPS και TNP (θερμική μετουσίωση στους 56οC). Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή επιβεβαίωσε υψηλότερα επίπεδα IgM ΦΑ για τα κοτόπουλα ελεύθερης βοσκής (Sasso) στις ίδιες ημέρες ζωής με τα συμβατικά εκτρεφόμενα κοτόπουλα (Ross308) και επιπρόσθετα παρουσιάστηκαν αξιοσημείωτες διαφοροποιήσεις για τα IgY ΦΑ μεταξύ των δύο γονότυπων μετά από επεξεργασία των ορών τους με ήπια αποδιατακτικά μέσα. Έτσι, ανοσολογικά οι δυο αυτοί γονότυποι φαίνεται πως διαφοροποιούνται ιδιαίτερα και οι μετρήσεις των επιπέδων των ΦΑ στον ορό (κυρίως IgM) αναδεικνύουν ικανοποιητικά αυτές τις διαφοροποιήσεις ενισχύοντας την πεποίθηση πως τα ΦΑ μπορούν να αποτελέσουν σημαντικούς βιοδείκτες στην βιομηχανία κρεοπαραγωγής.