Διερεύνηση του υποκυτταρικού εντοπισμού ιικών πρωτεϊνών και dsRNA που παράγονται κατόπιν μόλυνσης με ανασυνδυασμένους μπακουλοϊούς

Πρίφτι, Ιζαμπέλα

Study on the subcellular localization of viral proteins and dsRNA produced after infection with recombinant baculoviruses

Πτυχιακή εργασία

Author

Πρίφτι, Ιζαμπέλα

Date

2021-10-04

Advisor

Kolliopoulou, Anna

Πτυχιακή Εργασία (3.798Mb)

Keywords

Λεπιδόπτερα ; siRNA ; AcMNPV ; RNA παρεμβολή ; Δίκλωνο RNA ; Ιικός καταστολέας του RNAi ; Β2 πρωτεΐνη ; Μπακουλοϊός ; Σύστημα φορέα έκφρασης μπακουλοϊού

Abstract

Η διαχείριση επιβλαβών εντόμων μέσω της RNA παρεμβολής (RNAi) συνιστά μια μεθοδολογία με πολλές προοπτικές, που θεωρείται ακίνδυνη για το περιβάλλον και τον άνθρωπο. Ενδιαφέρουσα προσέγγιση είναι η παράδοση εξειδικευμένων μορίων dsRNA σε έντομα-στόχους, εγκαψιδιωμένων μέσα σε ιόμορφα σωμάτια (VLPs). Η RNA παρεμβολή, κατευθυνόμενη από μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs), αποτελεί ισχυρό αντιιικό μηχανισμό κατά RNA και DNA ιών σε πολλούς ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Ειδικότερα, ο μηχανισμός αυτός ξεκινά με την αναγνώριση του dsRNA ιικής προέλευσης στο κυτταρόπλασμα από το ένζυμο τύπου RNase-III Dicer-2 (Dcr2), μετατρέποντάς το σε siRNAs. Προκειμένου λοιπόν να καταστεί εφικτή η παραγωγή των dsRNA σε υψηλά επίπεδα, χρησιμοποιήθηκε ο ανασυνδυασμένος πολλαπλός πυρηνικός πολυεδρικός ιός AcMNPV, ο οποίος εκφράζει μια φθορίζουσα ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη του ιού Flock House που δρα ως παρεμποδιστής του RNAi (B2-GFP) και μια RNA φουρκέτα που στοχεύει στο γονίδιο της λουσιφεράσης (dsLuc). Η στρατηγική αποσκοπεί στην πρόσδεση πολλών μορίων B2 στα μόρια dsLuc που θα εκφράζονται, με στόχο την αποφυγή του κατακερματισμού τους από τη Dicer-2. Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της υποκυτταρικής κατανομής της B2, άρα και της φουρκέτας dsLuc, παρουσία φθοριζουσών ανασυνδυασμένων ιικών πρωτεϊνών (ODV, IE1, GP64, Ac93) για την καλύτερη αξιολόγηση της αύξησης των dsRNA. Συγχρόνως, πραγματοποιήθηκαν έλεγχοι σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο για την έκφραση του ιού. Επιπλέον, εκτιμήθηκαν τα επίπεδα παραγωγής των μορίων dsRNA σε μολυσμένα κύτταρα συγκριτικά με μη μολυσμένα. Ύστερα από σύγκριση με την υπάρχουσα αρθρογραφία, δείχθηκε ο πανομοιότυπος υποκυτταρικός εντοπισμός των ιικών πρωτεϊνών, ενώ η παρουσία της πρωτεΐνης Β2 φαίνεται να μην μεταβάλλει το βασικό μοτίβο του εντοπισμού των ιικών πρωτεϊνών κατά τη μόλυνση. Τέλος, η εντόπιση της πρωτεΐνης Β2-GFP κυρίως στον πυρήνα και η αύξηση των ολικών μορίων dsRNA στα μολυσμένα κύτταρα με τον ιό AcMNPV-dsLuc/B2-GFP, δείχνουν την πιθανή αύξηση των επιθυμητών dsRNA.

Abstract

The management of harmful insects through RNA interference (RNAi) is a methodology with many perspectives, which is considered as safe for the environment and humans. An interesting approach is the delivery of specific dsRNA molecules, encapsulated in virus-like particles (VLPs), to target insects. RNA interference, directed by small interfering RNAs (siRNAs), is a dynamic antiviral mechanism against RNA and DNA viruses in many eukaryotic organisms. In particular, this mechanism initially recognizes dsRNA molecules of viral origin in the cytoplasm by the enzyme RNase-III Dicer-2 (Dcr2), converting them into siRNAs. In order to enable the production of dsRNAs at high levels, a recombinant nucleopolyhedrovirus AcMNPV was used. This virus expresses a fluorescent recombinant Flock House virus protein that acts as an RNAi inhibitor (B2-GFP) as well as a RNA hairpin targeting the luciferase gene (dsLuc). This strategy aims to bind many B2 molecules on the expressed dsLuc molecules, in order to avoid their fragmentation by Dicer-2. The present study was focused on the study of the subcellular distribution of B2, and therefore of the dsLuc hairpin, under the presence of fluorescent recombinant viral proteins (ODV, IE1, GP64, Ac93) in order to better evaluate dsRNA accumulation. Moreover, the viral levels were evaluated by genomic and protein analyses. In addition, a comparison of dsRNA expression levels was performed between infected and uninfected cells. When compared with the existing literature, the subcellular localization of viral proteins was shown to be identical, while the presence of B2 protein did not seem to affect the basic pattern of viral protein localization during infection. Finally, the mainly nuclear localization of B2-GFP protein as well as the increase of total dsRNA molecules in cells infected with AcMNPV-dsLuc/B2-GFP virus, indicate the possible increase of the desired dsRNA.