Ο ρόλος του επιγενετικού παράγοντα EZH2, στη ρύθμιση του κύκλου ζωής του Ανθρωπίνου Κυτταρομεγαλοϊού (HCMV), σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος μολυσμένα και μη (U373MG)

Δεκαρέστου, Ζωή

The role of epigenetic factor EZH2, in the regulation of life cycle of Human Cytomegalovirus (HCMV), in infected and non glioblastoma cells (U373MG)

Πτυχιακή εργασία

Author

Δεκαρέστου, Ζωή

Date

2021-03-04

Advisor

Beloukas, Apostolos

Αποτελέσματα πειραματικής μελέτης (1.043Mb)

Keywords

HCMV ; EZH2 ; RhoA ; Γλοιοβλάστωμα

Abstract

Εισαγωγή: Ο Ανθρώπινος Κυτταρομεγαλοϊός (Human Cytomegalovirus, HCMV) α-νήκει στην οικογένεια των β – ερπητοϊών, έχοντας ως γενετικό υλικό, δίκλωνο DNA και είναι ένας ευρέως διαδεδομένος ιός, σε παγκόσμια κλίμακα. Επιπλέον, θεωρεί-ται ως ένας σημαντικός παθογόνος μικροοργανισμός καθώς υπάρχει κίνδυνος πρόκλησης σοβαρών νοσημάτων σε ανοσοκατεσταλμένους, κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης αλλά και σε άτομα με ανεπαρκές ανοσοποιητικό σύστημα. Επίσης, μέσω της ογκοτρόπου δράσης του, μπορεί να καθορίσει το φαινότυπο συγκεκρι-μένων τύπων όγκου, όπως του γλοιοβλαστώματος, ο οποίος θεωρείται ως ένας από τους πιο επιθετικούς τύπους καρκίνου του ανθρώπινου Κεντρικού Νευρικού Συστήματος. Σκοπός: Η συγκεκριμένη μελέτη έχει ως σκοπό την ανάδειξη του ρόλου του επιγε-νετικού παράγοντα ΕΖΗ2, καθώς και της RhoA GTPάσης, στην πρόοδο μόλυνσης του HCMV σε συγκεκριμένη κυτταρική σειρά γλοιοβλαστώματος (U373MG). Μέθοδος: Η κύρια μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε είναι η μέθοδος Ανοσοα-ποτύπωσης ή Western Blot. Η μέθοδος αυτή μας βοήθησε στο να μεταφέρουμε τις πρωτεΐνες από το πήκτωμα πολυακριλαμίδης σε μεμβράνες PVDF, με την εφαρμο-γή ηλεκτρικού πεδίου. Στην συνέχεια, ακολούθησε ανοσολογική αποτύπωση με ειδικά αντισώματα. Αποτελέσματα: Ακολουθώντας την παραπάνω μέθοδο, προέκυψαν αποτελέσματα, τα οποία παρατηρήθηκαν με τη χρήση κυττάρων γλοιοβλαστώματος (U373MG). Πιο συγκεκριμένα, στα κύτταρα γλοιοβλαστώματος παρατηρήθηκε μια τάση μείω-σης της έκφρασης της RhoA μεταξύ των μη μολυσμένων και μολυσμένων κυττάρων 18 και 72 ώρες μετά τη μόλυνση με τον HCMV. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η έκφρα-ση του επιγενετικού παράγοντα ΕΖΗ2 σε μη μολυσμένα και σε μολυσμένα κύττα-ρα, για 18 ώρες που όμως δεν παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη διαφορά στο επίπεδο έκφρασης του ΕΖΗ2. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκαν μικρότερα χρονικά ση-μεία μόλυνσης με τον ιό. Ειδικότερα, στην πρώιμη μόλυνση, 30 λεπτά δηλαδή, κα-θώς και στις 3, 24, 48 ώρες υπάρχει παρόμοιο επίπεδο μόλυνσης σε μολυσμένα και μη κύτταρα του γλοιοβλαστώματος. Βέβαια, σε μεγαλύτερο χρονικό επίπεδο (72 ώρες) υπάρχει μια τάση για μείωση έκφρασης του ΕΖΗ2. Κλείνοντας, μελετή-θηκαν και κύτταρα ινοβλαστών, στις 24 ώρες μόλυνσης, για να τα συγκρίνουμε με τα αποτελέσματα των κυττάρων του γλοιοβλαστώματος και παρατηρήθηκε μια τά-ση προς αύξηση του ΕΖΗ2 στα μολυσμένα κύτταρα, από τον HCMV. Συμπεράσματα: Από τα πειράματα που διενεργήθηκαν, προκύπτει ότι πιθανόν να υπάρχει μια σχέση ανάμεσα στη RhoA και τον Ανθρώπινο Κυτταρομεγαλοϊό, σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, η οποία όπως αποδείχθηκε, επιδρά σε διαφορετικά χρονικά σημεία της μόλυνσης. Επίσης, βάσει των μελετών που πραγματοποιήθη-καν, ο HCMV πιθανότατα να σχετίζεται με την έκφραση του επιγενετικού παράγο-ντα ΕΖΗ2, μολύνοντας κύτταρα γλοιοβλαστώματος με τον HCMV. Λαμβάνοντας υπόψιν την ογκοτρόπο δράση του HCMV, στην πρόοδο της νόσου του γλοιοβλα-στώματος, χρειάζονται παραπάνω μελέτες με σκοπό την περαιτέρω μελέτη των μη-χανισμών αλληλεπίδρασης των μορίων αυτών με τον Ανθρώπινο Κυτταρομεγαλοϊό και κατά πόσο η δράση τους σχετίζεται με την εξέλιξη της μόλυνσης από τον ιό.

Abstract

Introduction: Human Cytomegalovirus – HCMV belongs to the β – herpesviruses family and is a double – stranded DNA virus and is a widespread virus, worldwide. In addition, it is considered as an important pathogenic microorganism and there is a risk of causing serious diseases in immunocompromised during pregnancy and in people with insufficient immune system. Also, because of its oncogenic path-way, it can determine the phenotype of specific tumors, such as glioblastoma, which is considered one of the most aggressive types of cancer of human Central Nervous System. Purpose: The main goal of this study is to highlight the role of epigenetic factor EZH2 and as well as RhoA GTPase, in the progression of Human Cytomegalovirus in a specific glioblastoma cell line (U373MG). Method: The main methodology used is Immunoblotting or Western Blot. With this method, we can transfer proteins through polyacrylamide gel to PVDF mem-branes, applying an electric field. Afterwards, we used specially labeled antibodies to success an immune response analysis. Results: Following the above process, some results obtained using glioblastoma cells, U373MG. More specifically, it was observed a tendency to decrease of RhoA between non – infected and infected glioblastoma cells, 18 and 72 hours after HCMV infection. Then, the regulatory expression of epigenetic factor EZH2 was studied in non – infected and infected cells, about 18 hours, but no significant dif-ference was observed in the level of expression of EZH2. Because of that, we used shorter time points of infection with the virus. In particular, in early infection, i.e. 30 minutes, as well as 3, 24, 48 hours there is a similar level of infection in non – infected and infected glioblastoma cells. At a higher time point (72 hours) there is a tendency to reduce EZH2 expression. Eventually, fibroblast cells were studied at 24 hours of infection to compare them with the results of glioblastoma cells and there is a tendency to increase EZH2 in infected cells was observed. Discussion: The experiments have shown that there may be a link between RhoA and Human Cytomegalovirus in glioblastoma cells, which has been shown to affect different time points of infection. In addition, based on the studies performed, HCMV is most likely to related to the expression of the epigenetic factor EZH2, in-fecting glioblastoma cells with HCMV. Considering the oncogenic activity of HCMV, in the progression of glioblastoma disease, more studies are needed in order to further study the mechanisms of interaction of these molecules with HCMV and whether their action is related with the development of infection.