Πρωτεομική ανάλυση στελεχών τρίχας σε ενεργό φάση αύξησης παιδιατρικών ασθενών με Διαβήτη τύπου 1

Μιχαλόπουλος, Ιωάννης

Proteomic analysis of hair shafts in active growth phase of pediatric patients with type 1 diabetes

Πτυχιακή εργασία

Author

Μιχαλόπουλος, Ιωάννης

Date

2024-07-24

Advisor

Παπαναστασίου, Αναστάσιος

Ερευνητική πτυχιακή εργασία (10.70Mb)

Keywords

Πρωτεομική Ανάλυση ; Τρίχα ; Διαβήτης Τύπου 1 ; ΣΔ1 ; Υγρή χρωματογραφία ; Φασματομετρία μάζας ; Βιοπληροφορική ανάλυση ; Perseus ; Mass spec ; Proteomics ; LC-MS ; Θρυψίνη ; Αυτοανοσία ; Πρωτεομικό Προφίλ ; Ανίχνευση πεπτιδίου C ; Λογισμικό DIANN ; Λογισμικό Metascape ; Πρωτεΐνες οικογένειας ανοσοσφαιρινών ; Πρωτεΐνες Κερατίνης ; CXADR ; Coxsackie και υποδοχέας αδενοϊού ; Παιδιατρικός Διαβήτης ; Έγκαιρη Διάγνωση ; Βιοδείκτες ; Μοριακή Παθοφυσιολογία ; Στατιστική ανάλυση ; Proteome ; Ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών ; Παιδιατρική Ενδοκρινολογία ; Ρυθμός ανάπτυξης μαλλιών ; Απομόνωση πρωτεΐνης ; Πέψη πρωτεϊνών ; Protein Digestion ; Bioinformatics Analysis ; Protein Identification and Quantification ; Biomarkers ; Immunoglobulin ; HPLC ; C-peptide ; Autoimmunity ; Πρωτόκολλο Sp3 ; Q Exactive φασματόμετρο μάζας HF-X ; Λογισμικό Perseus ; Early Diagnosis

Abstract

ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΚΟΠΟΣ: Μελέτες έχουν δείξει ότι η αυτοανοσία στους ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 1 (ΣΔτ1) ξεκινάει αρκετό διάστημα πριν την εμφάνιση των κλινικών εκδηλώσεων. Η τρίχα στον άνθρωπο επιμηκύνεται κατά 1 cm ανά μήνα. Κατά την ανάπτυξη της τρίχας ενσωματώνονται ποικίλα ενδογενή μόρια με αποτέλεσμα ένα δείγμα τρίχας να μπορεί να παρέχει ένα προφίλ σε πρωτεΐνες που αντανακλά την έκθεση της σε μήνες. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να ταυτοποιηθεί το πρωτεομικό προφίλ σε δείγματα τρίχας μήκους 1 cm σε κορίτσια με πρωτοδιάγνωστο ΣΔ1, καθώς και η ανίχνευση του πεπτιδίου C στα μη διαβητικά άτομα . ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ: Τριάντα-δύο κορίτσια με πρωτοδιάγνωστο ΣΔ1 και τριάντα υγιή κορίτσια στρατολογήθηκαν με καταγραφή κλινικοεργαστηριακών δεδομένων. Τα δείγματα τριχών συλλέχθηκαν από την οπίσθια κορυφή του κρανίου με τη χρήση ψαλιδιού όσο το δυνατόν πλησιέστερα στη ρίζα της τρίχας και αποκόπησαν τα πρώτα 6 cm ανά 1 cm από κάθε κορίτσι. Οι πρωτεΐνες της τρίχας ανά εκατοστό απομονώθηκαν πιλοτικά για 36 δείγματα από 3 κορίτσια με ΣΔτ1 και 3 υγιή κορίτσια. Η πέψη τους πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο Sp3. Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συζευγμένη με φασματόμετρο μάζας Q Exactive HF-Χ για την ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση τους με το λογισμικό DIANN. Η στατιστική και βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων έγινε με τα λογισμικά Perseus και Metascape. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Ταυτοποιήθηκαν 1799 πρωτεΐνες από τα 36 δείγματα εκ των οποίων 346 πρωτεΐνες ήταν στατιστικώς σημαντικές. Σε όλα τα δείγματα μήκους 1 cm, οι ασθενείς με ΣΔ1 παρουσίασαν διαφορετική έκφραση στις πρωτεΐνες των κερατινών, της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών (IGKC, IGHA1, IGHG1-3), του υποδοχέα των ιών coxsackie και αδενοϊού (CXADR) καθώς και σε πρωτεΐνες που σχετίζονται με διάφορους μοριακούς μηχανισμούς της παθοφυσιολογίας του ΣΔ1. Δεν έγινε ανίχνευση του πεπτιδίου C, σε κανένα απο τα δείγματα. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα έδειξαν διαφορές στο πρωτεομικό προφίλ των τριχών των κοριτσιών με ΣΔ1 σε σύγκριση με τα υγιή κορίτσια. Η μελέτη επιβεβαιώνει ότι η αυτοανοσία ξεκινάει τουλάχιστον 6 μήνες πριν την εμφάνιση των κλινικών εκδηλώσεων.

Abstract

ABSTRACT INTRODUCTION-PURPOSE: Studies have shown that autoimmunity in patients with type 1 diabetes mellitus (T1DM) begins long before the onset of clinical manifestations. Human hair grows approximately 1 cm per month. During hair growth, various endogenous molecules are incorporated, resulting in a hair sample that can provide a protein profile reflecting exposure over months. The purpose of the present study is to identify the proteomic profile in 1 cm hair samples in girls with newly diagnosed T1DM, as well as the detection of C-peptide in non-diabetic individuals. MATERIAL-METHODS: Thirty-two girls with newly diagnosed T1DM and thirty healthy girls were recruited, with clinical and laboratory data recorded. Hair samples were collected from the posterior vertex of the scalp using scissors as close to the root as possible, and the first 6 cm of hair was cut off in 1 cm segments from each girl. Hair proteins per centimeter were isolated in a pilot study for 36 samples from 3 girls with T1DM and 3 healthy girls. Their digestion was performed according to the Sp3 protocol. Peptides were separated by high-performance liquid chromatography coupled with a Q Exactive HF-X mass spectrometer for their identification and quantification using the DIANN software. Statistical and bioinformatic analysis of the data was performed using Perseus and Metascape software. RESULTS: A total of 1799 proteins were identified from the 36 samples, of which 346 proteins were statistically significant. In all 1 cm length samples, patients with T1DM showed different expression in keratin proteins, the immunoglobulin family (IGKC, IGHA1, IGHG1-3), the coxsackie and adenovirus receptor (CXADR), as well as proteins related to various molecular mechanisms of the pathophysiology of T1DM. C-peptide was not detected in any of the samples. CONCLUSIONS: Preliminary results showed differences in the proteomic profile of hair from girls with T1DM compared to healthy girls. The study confirms that autoimmunity begins at least 6 months before the onset of clinical manifestations.