Ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την ταχεία ανίχνευση της μετάλλαξης M184V του ιού HIV-1

Abstract

Η λοίμωξη με τον ιό HIV απουσία θεραπείας μπορεί να εξελιχθεί στο Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας (AIDS). Αν και η αντιρετροϊκή θεραπεία (ART) καθιστά τη λοίμωξη HIV μια χρόνια διαχειρίσιμη κατάσταση, η εκτεταμένη μεταλλακτικότητα του HIV εμποδίζει την αποτελεσματικότητα της ART, καθιστώντας τα άτομα ευάλωτα σε ευκαιριακές λοιμώξεις και σε διαφόρους τύπους καρκίνου. Η μετάλλαξη M184V ανιχνεύεται στο κωδικόνιο 184 (αντιστοιχεί στην αντίστροφη μεταγραφάση -RT- του ιού), ευθύνεται για τη μετατροπή μιας μεθειονίνης (ATG) σε βαλίνη (GTG), και εμφανίζεται σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπευτικά σχήματα με NRTIs προκαλώντας υψηλού επιπέδου αντοχή στους αναστολείς RT λαμιβουδίνη και εμτρισιταβίνη. Στην παρούσα εργασία RNA το οποίο είχε απομονωθεί από δείγματα ατόμων θετικών στον ιό HIV υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή, και το cDNA που προέκυψε χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για 2 διαδοχικές αντιδράσεις nested PCR (τελικό προϊόν 485bp). Ακολούθως, εφαρμόστηκαν 2 παράλληλες στρατηγικές για την ταχεία ανίχνευση της M184V: α) Με χρήση της τεχνικής των RFLPs (Πολυμορφισμοί Μήκους Θραυσμάτων Περιορισμού - Restriction Fragment Length Polymorphisms), επιλέχθηκαν περιοριστικά ένζυμα που αναγνωρίζουν και κόβουν επιλεκτικά μόνο τη μεταλλαγμένη ή την αγρίου τύπου αλληλουχία. Μετά από πέψη για κάθε δείγμα σε ξεχωριστές αντιδράσεις και με τις 2 κατηγορίες ενζύμων, τα θραύσματα DNA ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης και σύμφωνα με το πρότυπο ζώνωσης που προέκυψε, ταυτοποιήθηκε η ύπαρξη ή όχι της μετάλλαξης β) Με χρήση της τεχνικής HRMA (Ανάλυση Τήξης Υψηλής Ευκρίνειας - High Resolution Melting Analysis), σε ασύμμετρη qPCR χρησιμοποιήθηκαν, πέραν του ειδικά σχεδιασμένου ζεύγους εκκινητών F και R (προϊόν 81bp), εναλλακτικά για κάθε δείγμα σε ξεχωριστές αντιδράσεις 3’-φωσφορυλιωμένοι ανιχνευτές που λειτουργούν επίσης ως εκκινητές R, οι οποίοι προσδένονται στη μεταλλαγμένη ή την αγρίου τύπου αλληλουχία (προϊόν 42bp). Τα 2 προϊόντα που προκύπτουν έχουν διαφορετικές Tm, που παρατηρούνται στις καμπύλες αποδιάταξης στο τέλος κάθε αντίδρασης. Η ύπαρξη ή όχι κορυφής στη συγκεκριμένη Tm υποδηλώνει την ύπαρξη ή όχι της μετάλλαξης.