Μοριακή διερεύνηση γονιδίων αντοχής έναντι των μακρολίδων (mefA/E, ermB, ermA/TR)

Δελέγκου, Μαρίνα

Molecular identification of macrolide resistance genes (mefA/E, ermB, ermA/TR)

Πτυχιακή εργασία

Author

Δελέγκου, Μαρίνα

Date

2024-10-10

Advisor

Tzanakaki, Georgina
Beloukas, Apostolos

Delegkou_19678054.pdf (2.654Mb)

Δήλωση συγγραφέα προπτυχιακής διπλωματικής εργασίας υπογεγραμμένη με φυσική υπογραφή (329.4Kb)

Keywords

Streptococcus pneumoniae ; Ωτίτιδα ; Μαστοειδίτιδα ; Μακρολίδες ; Μοριακές μέθοδοι ; Μικροβιακή αντοχή

Abstract

Εισαγωγή: Ο Streptococcus pneumoniae αποτελεί ένα ευκαιριακό παθογόνο του ανθρώπου το οποίο προκαλεί λοιμώξεις όπως μηνιγγίτιδα, σηψαιμία, πνευμονία, ωτίτιδα και μαστοειδίτιδα. Για την αντιμετώπιση τους χορηγούνται μεταξύ άλλων και μακρολίδες. Η μελέτη των κυριότερων γονιδίων τα οποία εμπλέκονται στο μηχανισμό αντοχής τους (ermB, mefA/E και ermA/TR) παρουσιάζει ενδιαφέρον ως προς την παρακολούθηση της εξέλιξης της. Σκοπός της μελέτης αποτελεί η ανάπτυξη μοριακής mPCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση των εν λόγω γονιδίων , με στόχο την εφαρμογή της τεχνικής απευθείας σε κλινικά δείγματα (ωτικό υγρό) ασθενών με μέση ωτίτιδα/μαστοειδίτιδα. Υλικά και μέθοδοι: Μελετήθηκαν συνολικά 90 θετικά κλινικά δείγματα θετικά για S. pneumoniae (ωτικά υγρά (ν=63) και στελέχη (ν=27)) ασθενών με οξεία μέση ωτίτιδα/μαστοειδίτιδα. Η μελέτη της ειδικότητας έγινε με τον έλεγχο της ευαισθησίας στα στελέχη (E-test) και της ευαισθησίας με διαδοχικές αραιώσεις βακτηριακού DNA. Αποτελέσματα: Η τεχνική ανιχνεύει ταυτόχρονα τα γονίδια αντοχής ermB, mefA/E και ermA/TR απευθείας σε βιολογικά υλικά με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Συνολικά η αντοχή στις μακρολίδες ανήλθε στο 43,33%. Οι ορότυποι που δεν καλύπτονται από τα PCV εμβόλια παρουσίασαν υψηλότερη ευαισθησία σε σχέση με αυτούς που καλύπτονται. Στη δεύτερη κατηγορία ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι ορότυποι 19Α με υψηλή αντοχή 82.6% (19/23) και ο 3 με αντοχή σε χαμηλότερα ποσοστά 13,3% (2/15). Συμπεράσματα: Η συγκεκριμένη τεχνική αποτελεί μία αξιόπιστη, ταχεία και χαμηλού κόστους μέθοδο ανίχνευσης των γονιδίων αντοχής στις μακρολίδες απευθείας σε κλινικά δείγματα. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην επιτήρηση της αντοχής του S. pneumoniae καθώς ανιχνεύεται απευθείας σε βιολογικά υλικά, πράγμα εξαιρετικά χρήσιμο καθώς συχνά η καλλιέργεια αποτυγχάνει.

Abstract

Introduction: Streptococcus pneumoniae is an opportunistic human pathogen that causes infections such as meningitis, septicemia, pneumonia, otitis media and mastoiditis. The latter infection is treated with the use of macrolide antibiotics, among others. The study of the main genes responsible for macrolide resistance (ermB, mefA/E και ermA/TR) helps to monitor its development. Purpose: The purpose of this research paper is the development of a multiplex PCR that allows the simultaneous detection of said genes. This technique is to be further applied on clinical samples of patients suffering from otitis media/ mastoiditis. Materials and methods: A total of 90 clinical samples positive for S. pneumoniae were studied (n1= 63 ear fluid, n2= 27 bacterial strains). The specificity of the method was tested through the E-test method applied in the bacterial strains and the sensitivity was determined by consecutive dilutions of the bacterial DNA. Results: The molecular method developed can simultaneously detect the ermB, mefA/E και ermA/TR genes responsible for macrolide resistance, directly on clinical samples. It also offers great sensitivity and specificity. The total macrolide resistance of the studied samples accumulated for 43,33%. Serotypes of S. pneumoniae that are not covered from the PCV vaccines are more sensitive than those covered. In the second category, it is important to talk about serotypes 19A with a total resistance up to 82,6% (19/23) and serotype 3 with 86,67% (13/15) sensitivity to macrolide antibiotics. Conclusions: The developed technique is a reliable, fast and low cost method of detection of genes that confer resistance to macrolide antibiotics. It is an important tool for monitoring the resistance of S. pneumoniae, as it can be applied directly on clinical samples, which can be useful when the bacterial culture is unsuccessful.