In vitro ιική μόλυνση με ιούς ηπατίτιδας και διερεύνηση του περιεχομένου των εξωσωμάτων

Μωράκου, Μαρία

In vitro hepatitis viral infection and study of exosomal content

Πτυχιακή εργασία

Author

Μωράκου, Μαρία

Date

2024-10-19

Advisor

Karamichali, Eirini

ΜΩΡΑΚΟΥ_18678030.pdf (5.694Mb)

Keywords

Ηπατίτιδα C ; HCV ; Εξωσώματα

Abstract

Ο ιός της ηπατίτιδας C (Hepatitis C Virus, HCV) ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae, διαθέτει ένα μονόκλωνο μόριο RNA θετικής πολικότητας μήκους περίπου 9,6 kb και είναι ένας από τους κύριους παράγοντες της ηπατικής νόσου. Η χρόνια HCV λοίμωξη, η οποία αφορά το 75% των ασθενών, προκαλεί σημαντικές βλάβες στο ήπαρ, οδηγώντας κάποιους ασθενείς σε ηπατική κίρρωση και ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Τα εξωκυτταρικά κυστίδια (Extracellular Vesicles, EVs) και ειδικότερα τα εξωσώματα, είναι πλέον γνωστό ότι συμβάλλουν στη διακυτταρική επικοινωνία μεταφέροντας νουκλεϊνικά οξέα, πρωτεΐνες και λιπίδια από κύτταρα δότες σε κύτταρα δέκτες. Ο HCV χρησιμοποιεί τα εξωσώματα για την μεταφορά του ιικού RNA συμβάλλοντας στην εγκαθίδρυση της ιικής μόλυνσης, την ενίσχυση του αναδιπλασιασμού του ιού και την διαφυγή του από την ανοσιακή απόκριση. Στόχος της εργασίας είναι η διερεύνηση του περιεχομένου των εξωσωμάτων σε ανοσοκατασταλτικούς παράγοντες ικανούς να προάγουν την ιική διαφυγή και την μειωμένη ανοσοεπιτήρηση, στην in vitro HCV μόλυνση, προ και μετά θεραπείας με αντιιικά άμεσης δράσης (Direct Acting Antivirals, DAAs). Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα μόλυνσης της ηπατικής κυτταροσειράς Huh7.5 με τον ιό HCV και στη συνέχεια θεραπεία της κυτταροσειράς, μέσω χρήσης αποτελεσματικού εγκεκριμένου φαρμακευτικού σκευάσματος, με σκοπό την εκρίζωση του ιού. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα και τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας που συλλέχθηκαν χρησιμοποιήθηκαν για τον μοριακό προσδιορισμό του ιικού αναδιπλασιασμού και την διερεύνηση του περιεχομένου των εκκρινόμενων εξωσωμάτων σε ανοσορυθμιστικούς παράγοντες, αντιστοίχως. Επιπλέον, διερευνήθηκε η παρουσία των ανοσορυθμιστικών παραγόντων Programmed death-ligand 1 (PD-L1) και Transforming Growth Factor β (TGF-β) στα εξωσώματα που απομονώθηκαν από τα υπερκείμενα κυτταροκαλλιέργειας με ανοσοστύπωση κατά Western και ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά την HCV in vitro μόλυνση προ και μετά θεραπείας, οι συγκεκριμένοι ανοσορυθμιστικοί παράγοντες μεταφέρονται μέσω των εξωσωμάτων και παρουσιάζουν διαφοροποιήσεις.

Abstract

Hepatitis C Virus (HCV) belongs to the Flaviviridae family, has a single-stranded positive-polarity RNA molecule of about 9.6 kb in length, and is one of the main causes of liver disease. Chronic HCV infection, which affects 75% of patients, causes significant liver damage, leading some patients to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). It is known that Extracellular Vesicles (EVs), and in particularly exosomes, it is known that they contribute to intercellular communication by transporting nucleic acids, proteins and lipids from donor cells to recipient cells. HCV uses exosomes in order to transport viral RNA, establish viral infection, enhance viral replication, and evade the immune response. The aim of the present study is to investigate the exosomal content for immunoregulatory factors that are capable of promoting viral escape and reduced immune surveillance, in in vitro HCV infection, before and after treatment with Direct Acting Antivirals (DAAs). For this purpose, in vitro experiments were carried out, whereby the liver cell line Huh7.5 was infected with HCV virus. Then we treated the cells with an effective approved DAA preparation in order to eradicate the virus. The harvestsed cell extracts and cell culture supernatants were used for molecular determination of viral replication and to study the exosomal content for immunoregulatory factors, respectively. This was followed by assaying for the presence of immunoregulatory factors Programmed death-ligand 1 (PD-L1) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) in isolated exosomes of cell culture supernatants by using Western blotting and ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). The results showed that during in vitro HCV infection, specific immune factors are transported through exosomes, varying in concetration before and after treatment.