Μοριακή ταυτοποίηση ειδών φλεβοτόμων από περιοχές της Ελλάδας με πρωτόκολλο multiplex PCR μετά την εφαρμογή διαφορετικών προσεγγίσεων απομόνωσης γενετικού υλικού και μοριακή ανίχνευση παθογόνων

Abstract

Στην υποοικογένεια Phlebotominae ανήκει πλήθος ειδών αιμομυζητικών φλεβοτόμων. Από αυτά, δύο γένη αποτελούν δυνητικούς διαβιβαστές ασθενειών στον άνθρωπο: οι φλεβοτόμοι του γένους Phlebotomus που απαντώνται στον Παλαιό Κόσμο και του γένους Lutzomyia που απαντώνται στον Νέο Κόσμο. Τα συγκριμένα έντομα μπορεί να μεταφέρουν ένα ευρύ φάσμα παθογόνων, όπως το βακτήριο Bartonella bacilliformis (αιτιολογικός παράγοντας της ασθένειας του Carrion), διάφορους ορότυπους του ιού των φλεβοτόμων (Pappataci fever) που κατατάσσεται στους αρμποϊούς, καθώς και το πρωτοζωικό παράσιτο Leishmania spp., το οποίο προκαλεί τη Λεϊσμανίαση, μια από τις πιο παραμελημένες τροπικές ασθένειες σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ). Η παρούσα ερευνητική πτυχιακή εργασία επικεντρώνεται στις φλεβοτόμους του γένους Phlebotomus δίνοντας έμφαση στα ανατομικά και μορφολογικά χαρακτηριστικά των συγκεκριμένων εντόμων, στον βιολογικό τους κύκλο, στην υγειονομική τους σημασία σε σχέση με την Δημόσια Υγεία, καθώς και σε μηχανισμούς ανίχνευσης και περιορισμού τους. Συγκεκριμένα, αξιοποιώντας διάφορα πρωτόκολλα απομόνωσης και ενίσχυσης γενετικού υλικού, όπως η μέθοδος πολυπλεκτικής PCR (multiplex PCR), αλλά και η άμεση μορφή αυτής (direct multiplex PCR, dmPCR), πραγματοποιήθηκε η μοριακή ταυτοποίηση φλεβοτόμων που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές της Ελλάδας σε επίπεδο είδους. Για την απομόνωση του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκαν είτε ολόκληρα έντομα (whole insects), είτε το πόδι αυτών (insect part). Με αντίστοιχες μοριακές μεθόδους, πραγματοποιείται και ο μοριακός έλεγχος των εντόμων για να διαπιστωθεί αν είναι φορείς κάποιου από τα προαναφερθέντα παθογόνα, τα οποία συνιστούν δυνητική απειλή για τη δημόσια υγεία. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκαν διάφορες μοριακής φύσεως προσεγγίσεις, όπως φωτομέτρηση DNA, ηλεκτροφόρηση και PCR πραγματικού χρόνου ανάγνωσης (real-time PCR). Τα δείγματα φλεβοτόμων που αξιοποιήθηκαν στο εργαστήριο προήλθαν, κυρίως, από εντομολογικές μελέτες που έλαβαν χώρα τα προηγούμενα έτη σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας, με στόχο την καταγραφή του επιπολασμού των ειδών Phlebotomus spp. και των πιθανών παθογόνων που αυτά μπορεί να μεταφέρουν.