Ανίχνευση και αξιολόγηση προγνωστικής αξίας DNA πολυμορφισμού στο αίμα ασθενών με ηλικιακή εκφύλιση ωχράς κηλίδας

Λευθεριώτου, Τατιανή

Detection and evaluation of the prognostic value of a DNA polymorphism in patients with age-related macular degeneration

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Λευθεριώτου, Τατιανή

Date

2022-02-11

Advisor

Καρκαλούσος, Πέτρος

Μεταπτυχιακή Εργασία (5.568Mb)

Keywords

Σημειακή μετάλλαξη ; Ωχρά κηλίδα ; Syn3/timp3

Abstract

Εισαγωγή: Η ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας (HEΩ) αποτελεί μία πολυπαραγοντική και εκφυλιστική νόσο του οφθαλμού που αφορά ασθενείς άνω των 50 ετών και μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική απώλεια της κεντρικής όρασης. Αν και η αιτιολογία της πάθησης δεν έχει πλήρως διευκρινισθεί, πλήθος γονιδίων έχουν ενοχοποιηθεί για τη συσχέτισή τους με την ΗΕΩ, ενώ πρόσφατα δεδομένα αλληλούχισης αποκάλυψαν την συμμετοχή πολλών χρωμοσωμικών τόπων στην ΗΕΩ. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την ΗΕΩ παρουσιάζει ο τόπος όπου εντοπίζονται τα γονίδια TIMP3/SYN3. Στον συγκεκριμένο γενετικό τόπο έχουν ανιχνευτεί αρκετοί σημειακοί πολυμορφισμοί (SNPs) κάποιοι από τους οποίους σχετίζονται με την εμφάνιση της ΗΕΩ. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση της κατανομής των διαφόρων γονοτύπων του μη κωδικοποιητικού πολυμορφισμού rs5754227, chr22:32709831 (GRCh38.p13) στους ασθενείς με ΗΕΩ και η συσχέτιση της κατανομής αυτής με τη μορφή της νόσου ανά φύλο και ηλικία των ασθενών. Υλικά-Μέθοδοι: Στη μελέτη συμμετείχαν 21 ασθενείς με ΗΕΩΚ ξηράς μορφής και 19 ασθενείς με ΗΕΩΚ υγρής μορφής, ελληνικής καταγωγής επιλεγμένοι κατόπιν οφθαλμολογικής αξιολόγησης και συλλογής κλινικών δεδομένων. Μετά την έγγραφη συναίνεση των ασθενών και την συλλογή περιφερικού αίματος τους ακολούθησε απομόνωση DNA και στη συνέχεια ο ποιοτικός και ποσοτικός έλεγχός του. Επιπλέον σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης είναι η ανάπτυξη αξιόπιστης και ευαίσθητης μεθοδολογίας αλληλούχισης κατά Sanger για την ανίχνευση του εξεταζόμενου πολυμορφισμού στους ασθενείς με ΗΕΩ. Έτσι πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση και σχεδιασμός των κατάλληλων PCR εκκινητών και η βελτιστοποίηση των συνθηκών της αλληλούχισης κατά Sanger για την αξιόπιστη ανίχνευση του πολυμορφισμού rs5754227. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τα λογισμικά SPSS και SNPSTATs. Αποτελέσματα: Οι δύο ομάδες ασθενών δε διέφεραν στατιστικά για το φύλο και την ηλικία. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η κατανομή των γονοτύπων ακολουθεί την κατανομή κατά Hardy-Weinberg (p>0,05) συνεπώς η γονοτύπηση είναι έγκυρη. Στο σύνολο των ασθενών το πιο συχνό αλλήλιο ήταν το Α με ποσοστό εμφάνισης 86% και το υπόλοιπο ήταν G (14%). Ο πιο συχνός γονότυπος ήταν ο Α/Α (72%), ακολουθούμενος από το γονότυπο A/G (28%). Πιο αναλυτικά, τα ποσοστά εμφάνισης των Α και G αλληλίων στην ομάδα ασθενών με ξηρή ΗΕΩ ήταν 88% και 12% αντίστοιχα, ενώ στην ομάδα ασθενών με υγρή ΗΕΩ τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 84% και 16%. Όσον αφορά τα ποσοστά εμφάνισης των Α/Α και A/G γονοτύπων, στην ομάδα ασθενών με ξηρή ΗΕΩ ήταν 76% και 24% αντίστοιχα ενώ στην ομάδα ασθενών με υγρή ΗΕΩ τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν 68% και 32%. Ο πολυμορφισμός εμφανίζει κίνδυνο ανάπτυξης της υγρής (32%) έναντι της ξηράς ΗΕΩ (24%), ωστόσο η πιθανότητα αυτός ο γονότυπος να αποτελεί κίνδυνο για ανάπτυξη της υγρής μορφής έχει OR=1,77 (95% CI 0,40-7,81) με διαστήματα εμπιστοσύνης που περιλαμβάνουν το 1 συνεπώς δεν είναι στατιστικά σημαντικός (P=0,45). Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, συνάδουν με μεγάλή πρόσφατη ευρωπαϊκή μελέτη όσον αφορά το ποσοστό εμφάνισης του πιο συχνού αλληλίου Α αλλά ο πολυμορφισμός G αντίκειται στα ποσοστά κατανομής του στην υγρή μορφή της ΗΕΩ, όπου είναι στατιστικά σημαντικά μικρότερος.

Abstract

Introduction: Age-related macular degeneration (AMD) is a multifactorial and degenerative eye disease that affects patients over 50 years and can lead to significant loss of vision. Although the etiology of the disease has not been fully clarified, several studies imply the implication of numerous genes in AMD pathogenesis, whereas recent sequencing data show that, many chromosomal sites are involved in AMD pathogenesis. Of particular interest is the chromosomal loci, where the TIMP3 / SYN3 genes are located. Several SNPs have been detected in this loci and some of them seems to be involved in AMD pathogenesis. In this study we aimed to investigate the distribution of several genotypes of the non-coding SYN3 rs5754227 polymorphism, chr22:32709831 (GRCh38.p13) among AMD patients and the correlation of this distribution among the sex and age of the patients. Materials and Methods: The study cohort consisted of 21 patients with dry AMD and 19 patients with wet AMD. The patients were selected after ophthalmic evaluation and a detailed database of their clinicopathological characteristics was created for the statistical analysis. After the written consent of the patients, DNA was isolated from peripheral blood followed by its qualitative and quantitative control. An additional purpose of the study was the development of a reliable and sensitive Sanger sequencing methodology for the detection of the examined polymorphism in patients with AMD. Thus, we initially performed in silico analysis and design of suitable PCR primers and then we proceeded to optimization of Sanger sequencing conditions for reliable rs5754227 polymorphism detection. Results: The two groups of patients weren’t statistically different according to sex and age. Our genotyping results were valid since they followed Hardy-Weinberg distribution (p>0.05). In the sum of the patients, the most frequent allele was A with occurrence rate 86% while the rest was G (14%). The most frequent genotype was A/A (72%) followed by A/G (28%). In more detail, the occurrence rates for the alleles A and G in patients with dry AMD were 88% and 12% respectively, while in patients with wet AMD were 84% and 16% respectively. Regarding the occurrence rates of genotypes A/A and A/G in patients with dry AMD were 76% and 24% respectively and in patients with wet AMD the equivalent rates were 68% and 32% respectively. The polymorphism shows an increased percentage in wet AMD (32%) compared to dry AMD (24%), however the OR=1.77 (95%CI 0.40-7.81) has confidence intervals that include 1 and therefore, no statistical significance. Conclusion: The results of the present study are in accordance with a large recent European study regarding the A allele being the major one however, the percentage of G polymorphism is statistically significant smaller compared to dry AMD.