Ανάπτυξη in-house πειραματικού πρωτοκόλλου για την αλληλούχηση του γονιδίου της Ιντεγκράσης του Ιού HIV-1 και την ανίχνευση πολυμορφισμών που μπορεί να σχετίζονται και με την ανάπτυξη αντοχής σε αντιρετροϊκή θεραπεία

Πρόκτερ, Κασσάνδρα

Development of an in-house protocol in order to sequence HIV-1 Integrase Gene and detect polymorphisms which may be associated with the emergence of drug resistance

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Πρόκτερ, Κασσάνδρα

Date

2022-10-04

Advisor

Beloukas, Apostolos
Gioti, Katerina

Μεταπτυχιακή Εργασία (2.648Mb)

Keywords

HIV ; Ιντεγκράση ; Αντοχή ; Αντιρετροϊκή θεραπεία ; Αλληλούχηση

Abstract

Εισαγωγή: Τα άτομα που έχουν μολυνθεί με τον ιό HIV έχουν πάψει πλέον να χαρακτηρίζονται ως φορείς ή ασθενείς της HIV λοίμωξης και αποκαλούνται άτομα που ζουν με τον ιό, καθώς η αντιρετροϊκή θεραπεία καταστέλλει πλήρως τον ιικό πολλαπλασιασμό. Η αντιρετροϊκή θεραπεία στοχεύει κατά βάση στην αναστολή της λειτουργίας τριών ιικών γονιδίων, της πρωτεάσης, της αντίστροφης μεταγραφάσης και της ιντεγκράσης. Παρόλα αυτά, ορισμένα στελέχη του ιού HIV φέρουν μεταλλάξεις, οι οποίες προσδίδουν αντοχή έναντι της αντιρετροϊκής θεραπείας, ο επιπολασμός της οποίας έχει εκτιμηθεί σε ποσοστό 7% στην Ευρώπη, 17% στη Βόρια Αμερική, και 5,3% στην Ελλάδα . Σκοπός: Αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε ένα in-house πειραματικό πρωτόκολλο για την εύρεση μεταλλάξεων που προσδίδουν αντοχή έναντι των αντιρετροϊκών φαρμάκων που στοχεύουν το γονίδιο της ιικής ιντεγκράσης. Μέθοδος: Το πρωτόκολλο περιλαμβάνει: α) απομόνωση ιικού RNA από ορό δείγματος, β) δημιουργία μονόκλωνου συμπληρωματικού cDNA και στη συνέχεια δίκλωνου DNA με PCR αντίστροφης μεταγραφής ενός βήματος, γ) ενίσχυση με φωλεακή και ειδικότερη PCR ενός μικρότερου τμήματος του γονιδίου της ιντεγκράσης, δ) καθαρισμός του παραγόμενου DNA, ε) προετοιμασία για αλληλούχηση κατά Sanger, στ) ανάλυση χρωματογραφημάτων αλληλούχησης με το λογισμικό SeqScape™ Software, και ζ) επεξεργασία σε βάσεις δεδομένων (HIV Drug Resistance Database, REGA HIV Subtyping Tool, Comet HIV-1) για την εύρεση μεταλλάξεων και γονοτύπων. Αποτελέσματα: Ύστερα από την αλληλούχηση κατά Sanger 40 δειγμάτων ατόμων που ζουν με HIV λοίμωξη, 2 εμφάνισαν μεταλλάξεις αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης (5%), οι οποίες προσέδιδαν στην πρώτη περίπτωση υψηλού επιπέδου αντοχή στα αντιρετροϊκά BIC, CAB, DTG, EVG, RAL και στη δεύτερη περίπτωση υψηλού επιπέδου αντοχή στους αναστολείς EVG, RAL και χαμηλού επιπέδου στους BIC, CAB, DTG. Από τα 40 δείγματα, 22 εμφάνισαν μεταλλάξεις πολυμορφισμού (55%), εκ των οποίων 12 έφεραν τη μετάλλαξη Μ50Ι (55%), 6 τη μετάλλαξη L74I (27%), 3 τη μετάλλαξη L74M (13%), και 1 έφερε τις μεταλλάξεις L74I και τη V151I (5%). Σχετικά με τη γονοτύπηση των δειγμάτων το 55% είναι γονότυπου G, το 27,5% γονότυπου Α, 10% γονότυπου Β, και 7,5% είναι ανασυνδυασμένοι γονότυποι (CRFs). Συμπεράσματα: Το in-house πειραματικό πρωτόκολλο, το οποίο αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε, ενδείκνυται για εύρεση μεταλλάξεων αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης. Εξαιτίας του μικρού αριθμού δειγμάτων δεν μπορεί να αχθεί συνολικό συμπέρασμα για τον επιπολασμό των μεταλλάξεων αντοχής στον ελληνικό πληθυσμό. Είναι αναγκαίο να πραγματοποιηθούν περισσότερες μελέτες για τις μεταλλάξεις αντοχής στο γονίδιο της ιντεγκράσης σε εγχώρια αλλά και σε παγκόσμια κλίμακα.

Abstract

Introduction: People who are infected with HIV virus have stopped been characterized as carriers or patients of the HIV infection but they are simply called people living with HIV, since the antiretroviral therapy suppresses completely the viral replication. The antiretroviral therapy targets mainly three viral genes, protease, reverse transcriptase and integrase. However, some of the HIV strains develop resistance mutations against the antiretroviral therapy, which prevalence have been estimated about 7% in Europe, 17% in North America, and 5,3% in Greece. Purpose: An in-house experimental protocol was developed and used in an attempt to find resistance mutations against the antiretroviral drugs which targets the viral integrase gene. Method: The protocol includes: a) viral RNA extraction from serum sample, b) construction of single stranded complementary cDNA clone and then double stranded DNA using one step reverse transcription PCR, c) amplification of a smaller segment of the integrase gene using specific nested PCR, d) purification of the DNA product, e) sample preparation for Sanger sequencing, f) analysis of the sanger sequencing results using SeqScape™ Software, and g) results processing using online data bases (HIV Drug Resistance Database, REGA HIV Subtyping Tool, Comet HIV-1) in order to detect resistance mutations and estimate the genotypes. Results: 40 samples of people living with HIV were submitted to Sanger sequencing and, 2 of them showed resistance mutations in the integrase gene (5%), which in the first case were associated with high level resistance to the antiretrovirals BIC, CAB, DTG, EVG, RAL and in the second case, they were associated with high level resistance to the inhibitors EVG and RAL and low level resistance to BIC, CAB, DTG. From 40 samples in total, 22 showed polymorphic mutations (55%) from which 12 was accompanied by the M50I accessory mutation (55%), 6 by the L74I (27%), 3 by the L74M (13%), and 1 brought both L74I and V151I (5%). Regarding the subtyping results, 55% is subtype G, 27,5% is Α, 10% is Β, and 7,5% belongs to circulating recombinant forms (CRFs). Discussion: The in-house experimental protocol which was developed and used, yielded sufficient results in finding resistance mutations in viral integrase gene. Due to the small number of samples it is impossible to draw overall conclusions about the prevalence of resistance mutations against integrase inhibitors in Greek population. More research needs to be done nationally and globally.