Αντιοξειδωτική και αντιμικροβιακή δράση φυσικών εκχυλισμάτων της ελληνικής χλωρίδας. Ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων

Τσάκνη, Αλίκη

Antioxidant and antimicrobial activity of natural extracts of the Greek flora. Identification of bioactive compounds

Διδακτορική διατριβή

Author

Τσάκνη, Αλίκη

Date

2024-06-14

Advisor

HOUHOULA, DIMITRA

Διδακτορική διατριβή (5.732Mb)

Keywords

Φυτικά εκχυλίσματα ; Φαινολικές ενώσεις ; Βιολογικές δραστηριότητες ; Ελληνική χλωρίδα ; Χρωματογραφικές τεχνικές

Abstract

Τα αρωματικά φυτά και τα εκχυλίσματά τους χρησιμοποιούνται ολοένα και περισσότερο από τον άνθρωπο λόγω των ευεργετικών επιδράσεών τους στην υγεία. Η μελέτη των φυτικών εκχυλισμάτων αποτελεί ένα επίκαιρο ζήτημα, καθώς τα τελευταία χρόνια οι βιομηχανίες φαρμάκων και τροφίμων προτιμούν τα φυσικά αντιοξειδωτικά αντί των συνθετικών. Τα εκχυλίσματα των φυτών και βοτάνων εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, όπως αντιοξειδωτική, αντιμικροβιακή, αντιφλεγμονώδη, αντικαρκινική, αντιμεταλλαξιογόνο δράση. Η διατριβή αυτή επικεντρώνεται στη μελέτη 17 διαφορετικών φυτικών εκχυλισμάτων από εδάφη της Ελληνικής χλωρίδας. Τα φυτά που μελετήθηκαν ανήκουν σε 6 διαφορετικές οικογένειες (Χειλανθή, Ιεροβοτανοειδή, Κνιδοειδή, Τιλιίδες, Μυρτίδες και Υπερικίδες). Τα συλλεχθέντα φυτά εξετάστηκαν ως προς το περιεχόμενό τους σε φαινολικά συστατικά, το αντιοξειδωτικό τους δυναμικό, την ικανότητα πρόληψης της βλάβης του DNA που προκαλείται από ρίζες υπεροξυλίου, την αντιμικροβιακή τους δράση έναντι επιλεγμένων Gram θετικών και Gram αρνητικών μικροοργανισμών και την κυτταροτοξική τους δράση επί ηπατικών κυττάρων. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης που είναι συζευγμένη με ανιχνευτή συστοιχίας διόδων χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί το φυτοχημικό προφίλ των δειγμάτων και να προσδιοριστούν οι φαινολικές ενώσεις τους. Τα φυτοχημικά συστατικά με τις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα εκχυλίσματα είναι το φλαβονοειδές, ρουτίνη και τα φαινολικά οξέα, βενζοϊκό, καφεϊκό και ροσμαρινικό οξύ. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η φασματομετρία μάζας προκειμένου να ταυτοποιηθούν τα χαρακτηριστικά θραύσματα των δευτερογενών μεταβολιτών και η αντίστοιχη αναλογία τους m/z. Η μέθοδος DPPH εφαρμόστηκε για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής ισχύος των φυτών. Σε σύγκριση με τα επιλεγμένα φυτικά εκχυλίσματα, η μέντα και η μαντζουράνα εμφάνισαν την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση με τιμές IC50 7,34 και 10,31 μg∙mL-1, αντίστοιχα. Από την άλλη μεριά, η τσουκνίδα και η λεβάντα χαρακτηρίστηκαν ως ανεπαρκή αντιοξειδωτικά με υψηλές τιμές IC50. Η πλειονότητα των υπόλοιπων φυτών έδειξε ικανοποιητική αντιοξειδωτική δραστικότητα. Η συνολική περιεκτικότητα των δειγμάτων σε φαινόλες προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu. Τα εκχυλίσματα των φύλλων των φαρμακευτικών βοτάνων εμφάνισαν αξιοσημείωτες υψηλές συγκεντρώσεις φαινολικών που κυμαίνονται μεταξύ των τιμών 97,32 και 1532,84 μg ΓΟ/mg ΞΥ, με το δεντρολίβανο και τη ρίγανη να είναι τα πιο πλούσια εκχυλίσματα σε πολυφαινόλες. Ακόμα, μελετήθηκε η ισχύς των εξεταζόμενων εκχυλισμάτων στην αναστολή της κοπής του DNA που προκαλείται από ρίζες υπεροξυλίου. Η ικανότητα του εκχυλίσματος της μέντας (135 μg∙mL-1) να προστατεύει το DNA αξιολογήθηκε και βρέθηκε ότι είναι το πιο αποτελεσματικό βότανο με 98,98 % αναστολή της κοπής του DNA. Τα υπόλοιπα φυτικά εκχυλίσματα έδειξαν επίσης υψηλό επίπεδο προστασίας έναντι της βλάβης του DNA, εκτός από αυτά της τσουκνίδας και της λεβάντας στην ίδια συγκέντρωση (135 μg∙mL-1). Επιπρόσθετα, εξετάστηκε η αντιμικροβιακή αποτελεσματικότητα των υδατικών φυτικών εκχυλισμάτων έναντι έξι παθογόνων μικροοργανισμών, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica, Escherichia coli και Klebsiella pneumoniae και εκφράστηκε με τις τιμές MIC. Τα περισσότερα δείγματα εμφάνισαν σημαντική αντιβακτηριακή δράση έναντι των παθογόνων, εκτός από κάποιες εξαιρέσεις. Τέλος, εφαρμόστηκε η μέθοδος AlamarBlue για να αξιολογηθεί το κυτταροτοξικό δυναμικό των 17 δειγμάτων έναντι των ηπατικών κυττάρων Huh 7. Τα αποτελέσματα της μεθόδου παρουσιάζονται με τις τιμές CC50 και γίνεται αντιληπτό ότι τα περισσότερα εκχυλίσματα έχουν χαμηλή κυτταροτοξικότητα έναντι των ηπατικών κυττάρων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας, εξάγεται το συμπέρασμα ότι τα αρωματικά φυτά της ελληνικής χλωρίδας ενισχύουν την ανθρώπινη υγεία και προλαμβάνουν ένα ευρύ φάσμα ασθενειών. Τα ευρήματα αυτά αποτελούν τη βάση για μελλοντικές μελέτες που αφορούν τα ίδια είδη φυτών.

Abstract

Aromatic plants and their extracts are increasingly used by humans due to their beneficial effects on health. The study of plant extracts is a current issue, as in recent years the pharmaceutical and food industries prefer natural antioxidants to synthetic ones. The extracts of plants and herbs show a wide range of biological activities, such as antioxidant, antimicrobial, anti-inflammatory, anticancer, antimutagenic activity. This thesis focuses on the study of 17 different plant extracts from soils of the Greek flora. The plants studied belong to 6 different families (Lamiaceae, Verbenaceae, Urticacea, Tiliaceae, Myrtaceae, Hypericaceae). The collected plants were examined for their phenolic content, their antioxidant potential, their ability to prevent DNA damage caused by peroxyl radicals, their antimicrobial activity against selected Gram-positive and Gram-negative microorganisms and their cytotoxic activity against liver cells. Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography coupled to a diode array detector was used to determine the phytochemical profile of the samples and determine their phenolic compounds. The phytochemical constituents with the highest concentrations in the extracts are the flavonoid, rutin and the phenolic acids, benzoic, caffeic and rosmarinic acid. Furthermore, mass spectrometry was used in order to identify the characteristic fragments of the secondary metabolites and their corresponding m/z ratio. The DPPH method was applied to evaluate the antioxidant potency of plants. Compared to the selected plant extracts, Mentha piperita L. and Origanum majorana L. showed the best antioxidant activity with IC50 values 7.34 and 10.31 μg∙mL-1, respectively. On the other hand, Urtica dioica L. and Lavandula angustifolia L. were characterized as insufficient antioxidants with high IC50 values. The majority of the other plants showed satisfactory antioxidant activity. The total phenol content of the samples was determined by the Folin-Ciocalteu method. Leaf extracts of medicinal herbs showed remarkably high concentrations of phenolics ranging between 97.32 and 1532.84 μg GAE/mg DW, with Salvia rosmarinus L. and Origanum vulgare L. being the richest extracts in polyphenols. Moreover, the potency of the examined extracts in inhibiting peroxyl radical-induced DNA scission was monitored. The ability of Mentha piperita L. (135 μg∙mL-1) to protect DNA was evaluated and found to be the most effective herb with 98.98 % inhibition of DNA cleavage. The other plant extracts also exhibited a high level of protection against DNA damage, except from the extracts of Urtica dioica L. and Lavandula angustifolia L. at the same concentration (135 μg∙mL-1). In addition, antimicrobial efficiency of the aqueous natural extracts was examined against six pathogens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and expressed as MIC values. Most of the tested plants showed significant antibacterial activity against pathogens, with some exceptions. Finally, the AlamarBlue method was applied to evaluate the cytotoxic potential of the 17 samples against Huh 7 liver cells. The results of the method are represented with the CC50 values, and it becomes noticeable that most extracts have low cytotoxicity against liver cells. According to the results of this research, it is concluded that the aromatic plants of the Greek flora enhance human health and prevent a wide range of diseases. These findings form the basis for future studies concerning the same plant species.