Ημιποσοτικός προσδιορισμός μαλακού σίτου σε σκληρό σίτο με real time pcr για έλεγχο νοθείας στην ελληνική αγορά ζυμαρικών

Φούντας, Λάζαρος

Semiquantitative determination of common wheat in durum wheat with real time pcr for adulteration test in the greek pasta market

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Φούντας, Λάζαρος

Date

2023-07

Advisor

HOUHOULA, DIMITRA

Μεταπτυχιακή εργασία (1.972Mb)

Δήλωση συγγραφέα μεταπτυχιακής εργασίας (633.2Kb)

Keywords

Νοθεία ζυμαρικών με μαλακό σίτο ; Ημιποσοτικός προσδιορισμός ; Σκληρός σίτος ; Real time PCR

Abstract

Τα ζυμαρικά σίτου φτιάχνονται κυρίως από σκληρό σιτάρι και αποτελούν σημαντικό κομμάτι της σύγχρονης διατροφής του ανθρώπου παγκοσμίως. Τα τυποποιημένα ζυμαρικά που αναφέρουν στην ετικέτα προϊόντος ότι φτιάχνονται από σκληρό σίτο (Triticum durum) οφείλουν, σύμφωνα με την νομοθεσία της Ελλάδας και άλλων χωρών, να φτιάχνονται αποκλειστικά από σιμιγδάλι ή άλευρο σκληρού σίτου. Εντούτοις, είναι πιθανό να λάβει χώρα νοθεία των ζυμαρικών σκληρού σίτου με το χαμηλότερης αξίας άλευρο μαλακού σίτου (Triticum aestivum). Στα πλαίσια αυτά και για τον έλεγχο κάθε απόπειρας νοθείας αναπτύχθηκαν τις τελευταίες δεκαετίες διάφορες μέθοδοι για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του μαλακού σίτου σε ζυμαρικά σκληρού σίτου, όπως οι ανοσοχημικές, οι φασματοσκοπικές και οι μοριακές. Σκοπός της μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας, ήταν αρχικά η ανάπτυξη μιας μοριακής μεθόδου για την ανίχνευση και τον ημιποσοτικό προσδιορισμό του μαλακού σίτου σε δείγματα ζυμαρικών σκληρού σίτου. Μετά την ανάπτυξη της μεθόδου και την επαλήθευση της καταλληλότητας της, εφαρμόστηκε σε 27 δείγματα διαφόρων τύπων ζυμαρικών σκληρού σίτου της ελληνικής αγοράς λιανεμπορίου, προκειμένου να γίνει έλεγχος πιθανής νοθείας τους με μαλακό σίτο σε ποσοστό μεγαλύτερο του 3% w/w ως προς τον σκληρό σίτο των ζυμαρικών. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε για την επίτευξη του παραπάνω σκοπού περιλαμβάνει αρχικά την απομόνωση του DNA με το εμπορικό κιτ Nucleospin Food (Macherey – Nagel) και ακολούθως εφαρμογή της τεχνικής της Real Time PCR για την ανίχνευση και τον ημιποσοτικό προσδιορισμό του μαλακού σίτου στα 27 δείγματα ζυμαρικών που επιλέχθηκαν για την συγκεκριμένη ερευνητική εργασία. Με την χρήση του Nucleospin Food kit απομονώθηκε από τα δείγματα επαρκής ποσότητα DNA υψηλής καθαρότητας χωρίς την παρουσία παρεμποδιστών. Ακολούθως, η μέθοδος της Real Time PCR είχε ευαισθησία και εξειδίκευση 100%, ενώ η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγικότητα είχαν RSD% μικρότερη του 5%. Από την ανάλυση των δειγμάτων προέκυψε ότι και στα 27 δείγματα ζυμαρικών ανιχνεύθηκε η παρουσία μαλακού σίτου αλλά σε όλα το ποσοστό μαλακού σίτου ήταν μικρότερο του 3%. Πιο αναλυτικά, 2 δείγματα περιείχαν μαλακό σίτο σε ποσοστό μικρότερο του 3% και μεγαλύτερο του 1%, ενώ τα υπόλοιπα 25 δείγματα περιείχαν μαλακό σίτο σε ποσοστό μικρότερο του 1%. Η μέθοδος που εφαρμόστηκε αποδείχτηκε κατάλληλη (fit for purpose) για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό σε ζυμαρικά. Από την μελέτη των 27 δειγμάτων ζυμαρικών δεν διαπιστώθηκε στην Ελληνική αγορά ζυμαρικών εσκεμμένη νοθεία με μαλακό σίτο σε ποσοστό μεγαλύτερο του 3%. H μέθοδος του ημιποσοτικού προσδιορισμού είναι αξιόπιστη, γρήγορη και χαμηλού κόστους συγκριτικά με άλλες χημικές αλλά και μοριακές ποσοτικές μεθόδους. Τέλος θα πρέπει να τονισθεί ότι η καταπολέμηση της νοθείας των ζυμαρικών και παράλληλα η προστασία των καταναλωτών, απαιτεί τον διαρκή και συστηματικό έλεγχο της ελληνικής λιανικής αγοράς.

Abstract

Wheat pasta are mainly made from durum wheat and are an important part of the modern human diet worldwide. Commercial pasta products that state on the product label that they are made from durum wheat (Triticum durum) must, according to the legislation of Greece and other countries, be made exclusively from durum wheat semolina or flour. However, adulteration of durum wheat pasta with the lower value soft wheat (Triticum aestivum) flour may take place. In this context and in order to detect any attempted adulteration, various methods for the detection and quantification of common wheat in durum wheat pasta have been developed in recent decades, such as immunochemical, spectroscopic and molecular methods. The aim of the MSc thesis was firstly to develop a molecular method for the detection and semiquantitative determination of soft wheat in durum wheat pasta samples. After the method was developed and verified as fit for purpose, it was applied to 27 samples of various types of pasta from the Greek retail market, in order to check for possible adulteration with soft wheat. The method developed and applied in order to achieve the above objective, includes firstly the isolation of DNA with the commercial Nucleospin Food kit (Macherey - Nagel) and then the application of the Real Time PCR technique for the detection and semiquantitative determination of common wheat in 27 pasta samples selected for this research work. The use of the Nucleospin Food Kit allowed the isolation of sufficient amount and high purity DNA from the samples, without the presence of inhibitors. The Real Time PCR method was 100% sensitivite and specific, while repeatability and reproducibility showed RSD% less than 5%. The analysis of the samples showed that soft wheat was detected in all 27 samples of pasta but the percentage was less than 3%. More specifically, 2 samples contained soft wheat in a percentage less than 3% and more than 1%, while the remaining 25 samples contained soft wheat below 1% w/w. The method applied proved to be fit for purpose for the semiquantitative determination of soft wheat in pasta. From the study of 27 pasta sample, no deliberate adulteration with soft wheat, at a percentage greater than 3%, was found in the Greek pasta market. The method of semiquantitative determination is reliable, fast and low cost compared to other chemical and molecular quantitative methods. Finally, it should be emphasized that the fight against pasta adulteration and the protection of consumers requires the continuous and systematic monitoring of the Greek retail market.