Μελέτη μεταβολικού αποτυπώματος μητρικού γάλακτος με φασματοσκοπία NMR και πολυμεταβλητή στατιστική ανάλυση

Abstract

Το μητρικό γάλα αποτελεί ένα εξαιρετικά περίπλοκο και μεταβλητό βιολογικό υγρό και έχει μεγάλη θρεπτική και ανοσολογική αξία για το νεογνό. Ειδικότερα το πρωτόγαλα έχει κυρίως ανοσολογικό ρόλο προστατεύοντας το βρέφος, καθώς μεταβαίνει από το σχετικά στείρο περιβάλλον της μήτρας, σε ένα περιβάλλον με παθογόνους μικροοργανισμούς και περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις ολιγοσακχαριτών και πολλούς αυξητικούς παράγοντες, που είναι σημαντικοί για τη διατροφή, την ανάπτυξη του νεογνού και του προσφέρουν παθητική ανοσία. Η ανάλυση της σύνθετης και δυναμικής σύστασης του μητρικού γάλακτος και των παραγόντων που την επηρεάζουν, αποτελεί μία ερευνητική πρόκληση και ένα πεδίο μεγάλου ενδιαφέροντος. Η παρούσα διπλωματική εργασία, έχει ως στόχο τη συγκριτική μελέτη του μεταβολικού αποτυπώματος του πρωτογάλακτος, που προέρχεται από υγιείς μητέρες τελειόμηνων νεογνών, με διαφορετικά ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά και διατροφικές συνήθειες. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκαν φάσματα πρωτονίου πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) από μεταβολομική μελέτη στα δείγματα πρωτογάλακτος, που είχε διεξαχθεί σε προηγούμενο στάδιο. Συγκεκριμένα, η παρούσα μελέτη περιλαμβάνει την ομαδοποίηση δεδομένων ερωτηματολογίου, που είχε συμπληρωθεί κατά τη λήψη του βιολογικού υλικού από τις μητέρες, την επεξεργασία των φασμάτων NMR που ελήφθησαν από τα δείγματα και την πολυμεταβλητή ανάλυση στη μήτρα δεδομένων που προέκυψε. Η πολυμεταβλητή ανάλυση αποσκοπούσε στην εύρεση τυχόν διαφορών, τάσεων και συσχετίσεων μεταξύ των δειγμάτων, την επισήμανση των φασματικών περιοχών και κατά συνέπεια των μεταβολιτών που συμβάλλουν κυρίως σε αυτές τις διαφορές και την κατασκευή ενός προγνωστικού μοντέλου, για τη σωστή ταξινόμηση νέων δειγμάτων. Από την πολυμεταβλητή ανάλυση προέκυψε μία φυσική τάση διαχωρισμού των δειγμάτων σε δύο ομάδες και με βάση αυτήν αναγνωρίστηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν οι μεταβολίτες που υπήρχαν στις δύο ομάδες. Επίσης προέκυψε ένα επικυρωμένο στατιστικό μοντέλο διάκρισης OPLS-DA με Q2=0,64 και R2=0,73, που υποδηλώνουν την καλή ικανότητα πρόβλεψης και προσαρμογής του μοντέλου αντίστοιχα. Η ταυτοποίηση των φασμάτων, οδήγησε στον ποσοτικό προσδιορισμό 26 μεταβολιτών, με στατιστικώς σημαντικές διαφορές στις σχετικές τους συγκεντρώσεις μεταξύ των δύο ομάδων. Ακολούθησε νέα πολυμεταβλητή ανάλυση από τις σχετικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών για το κάθε δείγμα, από την οποία προέκυψε ένα επικυρωμένο μοντέλο διάκρισης OPLS-DA, με πολύ καλή ικανότητα πρόβλεψης και προσαρμογής (Q2=0,93 και R2=0,94). Με τη βοήθεια ενός διαγράμματος σημαντικότητας (VIP Plot), προσδιορίστηκαν οι μεταβολίτες ομοβανιλλικό οξύ, 2-οξοϊσοβαλερικό οξύ, θρεονικό οξύ, L-σερίνη, D-φρουκτόζη, D-γλυκόζη, γλυκολικό οξύ, ιππουρικό οξύ, γλυκερικό οξύ και L-λευκίνη, οι οποίοι είχαν τη μεγαλύτερη επίδραση στη διάκριση των ομάδων του μοντέλου αυτού. Από τους μεταβολίτες αυτούς, προσδιορίστηκαν τα μεταβολικά μονοπάτια που επηρεάζονται και τα οποία περιλαμβάνουν τη βιοσύνθεση και αποικοδόμηση βαλίνης, λευκίνης και ισολευκίνης, το μεταβολισμό γλυκοξυλικού και δικαρβοξυλικού οξέος, το μεταβολισμό γλυκίνης, σερίνης και θρεονίνης και τη βιοσύνθεση του αμινοάκυλο-tRNA. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μονομεταβλητή ανάλυση για τους 26 μεταβολίτες, σε σχέση με τις ομάδες που προέκυψαν από τις απαντήσεις και ομαδοποιήσεις του ερωτηματολογίου και διαπιστώθηκε η ύπαρξη μεταβολιτών, που έχουν μεγαλύτερη επίδραση στο διαχωρισμό μεταξύ δύο ομάδων του ερωτηματολογίου, χωρίς όμως να είναι δυνατή η γενίκευση των αποτελεσμάτων και των σχετικών παρατηρήσεων. Συμπερασματικά, η φυσική τάση διαχωρισμού των μελών του δειγματοχώρου μας σε δύο ομάδες, δεν μπόρεσε να συσχετιστεί με τις απαντήσεις του ερωτηματολογίου και έτσι πιθανά να οφείλεται σε άλλες παραμέτρους, οι οποίες θα μπορούσαν να αποτελέσουν βάση, για διατύπωση νέων ερευνητικών ερωτημάτων.