Επίδραση περιβαλλοντολογικών παραγόντων στην ανάπτυξη του Aspergillus carbonarius και στη παραγωγή ωχρατοξίνης Α

Abstract

Η παρούσα μελέτη ασχολήθηκε με την ανάπτυξη τεσσάρων ωχρατοξινογόνων στελεχών (F24, F70, F71 και F80) του μύκητα Aspergillus carbonarius και τη παραγωγή της ωχρατοξίνης Α (ΟΤΑ) υπό διαφορετικές θερμοκρασίες ανάπτυξης. Η μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας δύο βιολογικές επαναλήψεις με τέσσερις τεχνικές επαναλήψεις. Η αναγέννηση των μυκήτων πραγματοποιήθηκε από τους -80⁰C και καλλιεργήθηκαν σε Malt Extra Agar στους 25⁰C για 7 ημέρες με σκοπό την συλλογή και καταμέτρηση των σπορίων με τη χρήση αντικειμενοφόρου πλάκας Neubauer. Τα στελέχη, εμβολιάστηκαν σε υπόστρωμα με βάση το καλαμπόκι σε τρυβλία Petri με ενεργότητα ύδατος 0,93 και pH 6,96 και επωάστηκαν στις θερμοκρασίες 15, 20, 25, 30 και 35⁰C. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρυθμός ανάπτυξης τους στις διάφορες θερμοκρασίες, ενώ παράλληλα μετρήθηκε και η συγκέντρωση ωχρατοξίνης Α (OTA) σε τρία στάδια ανάπτυξης του μύκητα. Στο πρώτο στάδιο ανάπτυξης, ο μύκητας είχε παράξει τα πρώτα σπόρια στο τρυβλίο, στο δεύτερο στάδιο η ανάπτυξη του μύκητα είχε καλύψει το μισό τρυβλίο (≃4,2 cm), ενώ στο τρίτο στάδιο η ανάπτυξη του μύκητα είχε καλύψει το σύνολο του τρυβλίου (≃8,5 cm). Ο προσδιορισμός της OTA πραγματοποιήθηκε μετά από εκχύλιση με βαθμιδωτή έκλουση εκχυλιστικού διαλύματος (80% μεθανόλη, 20% νερό) και στη συνέχεια με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) χρησιμοποιώντας συγκεκριμένο πρωτόκολλο. Από τα αποτελέσματα, παρατηρήθηκε πως η βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης και για τα τέσσερα στελέχη ήταν στους 30⁰C, ενώ η ελάχιστη στους 15⁰C. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι το στέλεχος F80 είχε προβάδισμα στην ανάπτυξη του στις περισσότερες θερμοκρασίες με εξαίρεση στους 35⁰C όπου είχε πιο αργή ανάπτυξη από τα υπόλοιπα στελέχη. Εν συνεχεία, στο πρώτο στάδιο ανάπτυξης, παρατηρήθηκε ότι η συγκέντρωση της OTA των στελεχών, δεν είχε σημαντικές διαφορές μεταξύ των θερμοκρασιών, σε αντίθεση με το δεύτερο και το τρίτο στάδιο όπου η μέγιστη συγκέντρωση εντοπίστηκε στους 15⁰C, μετά από ανάλυση με HPLC. Εξαίρεση αποτελεί το στέλεχος F80, όπου στο δεύτερο στάδιο ανάπτυξης η υψηλότερη συγκέντρωση OTA καταγράφηκε στους 25⁰C. Η χαμηλότερη συγκέντρωση ωχρατοξίνης Α παρατηρήθηκε στους 35⁰C για όλα τα στελέχη. Αξίζει να αναφερθεί ότι στους 35⁰C, όλα τα στελέχη στο πρώτο στάδιο ανάπτυξης τους είχαν χαμηλή τιμή συγκέντρωσης ΟΤΑ, στο δεύτερο στάδιο η συγκέντρωση της ΟΤΑ που μετρήθηκε ήταν υψηλότερη, ενώ στο τρίτο στάδιο ανάπτυξης οι τιμές συγκέντρωσης της ΟΤΑ ελαττώνονται σε σύγκριση με τις υπόλοιπες θερμοκρασίες όπου στο τρίτο στάδιο η συγκέντρωση είναι υψηλότερη από το πρώτο και το δεύτερο στάδιο ανάπτυξης. Παρατηρήθηκε επίσης πως το στέλεχος F71 είχε διαφορετικό ρυθμό ανάπτυξης μεταξύ των 2 επαναλήψεων, και συγκεκριμένα στην πρώτη επανάληψη καταγράφηκε αργός ρυθμός ανάπτυξης και υψηλότερη συγκέντρωση ωχρατοξίνης Α, ενώ στη δεύτερη επανάληψη παρατηρήθηκε ταχύτερος ρυθμός ανάπτυξης και χαμηλότερη συγκέντρωση OTA. Συμπερασματικά, από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι τα θρεπτικά συστατικά του καλαμποκιού αποτελούν πηγή τροφής για το μύκητα, ενώ υπό κατάλληλες περιβαλλοντικές συνθήκες ευνοούν την ανάπτυξή του. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι η παραγωγή της ωχρατοξίνης Α επηρεάζεται τόσο από την θερμοκρασία όσο και από το στάδιο ανάπτυξης του μύκητα ενώ παράλληλα τα θρεπτικά συστατικά του καλαμποκιού φαίνεται να ευνοούν την παραγωγή της ΟΤΑ.