Σύγκριση μεθόδων εκχύλισης βακτηριακού DNA και μοριακών τεχνικών για την ανίχνευση τροφιμογενών παθογόνων

Χορμόβας, Χρυσοβαλάντης-Ιωάννης; Τσέτσο, Γεώργιος

Comparison of bacterial DNA extraction methods and molecular techniques for the detection of foodborne pathogens

Πτυχιακή εργασία

Author

Χορμόβας, Χρυσοβαλάντης-Ιωάννης

Τσέτσο, Γεώργιος

Date

2022

Advisor

HOUHOULA, DIMITRA

Πτυχιακή εργασία (1.826Mb)

Keywords

LAMP ; Τεχνικές ανίχνευσης DNA ; Μοριακές μέθοδοι

Abstract

Οι λοιμώξεις που προκαλούνται από τροφιμογενή παθογόνα βακτήρια αποτελούν ακόμα και σήμερα ένα φλεγόμενο ζήτημα για την δημόσια υγεία και την κοινωνία. Ο αριθμός των ετήσιων λοιμώξεων είναι σημαντικός με αποτέλεσμα η έγκαιρη και έγκυρη ανίχνευση των παθογόνων βακτηρίων στα τρόφιμα να θεωρείται κρίσιμο σημείο κατά την παραγωγή και επεξεργασία των τροφίμων. Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται την σήμερον ημέρα για την εύρεση των παθογόνων βακτηρίων είναι χρονοβόρες ή και απαιτούν εξειδικευμένο εξοπλισμό. Κατά συνέπεια είναι υψίστης σημασίας η ανάπτυξη νέων, ταχέων και αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης παθογόνων μικροοργανισμών που θα μπορούν να αξιοποιηθούν άμεσα από την βιομηχανία των τροφίμων. Σκοπός της συγκεκριμένης πειραματικής εργασίας αποτελεί η αξιολόγηση της τεχνικής Ισοθερμικής Ενίσχυσης Μέσω Βρόγχου (LAMP) όσον αφορά την ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών σε δείγματα γάλακτος. Στη συνέχεια είναι επιθυμητή η σύγκριση της ευαισθησίας της μεθόδου LAMP με την μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) καθώς και η σύγκριση δύο μεθόδων απομόνωσης του βακτηριακού DNA. Τα δείγματα γάλακτος επιμολύνθηκαν με γνωστές συγκεντρώσεις Salmonella Typhimurium και Listeria monocytogenes ενώ στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η απομόνωση του DNA. Η απομόνωση του DNA των παθογόνων βακτηρίων πραγματοποιήθηκε με δύο διαφορετικές μεθόδους. Η πρώτη μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν η χρήση ενός εμπορικού kit απομόνωσης DNA ενώ η δεύτερη μέθοδος ήταν μία in-house τεχνική που περιλάμβανε την χρήση βρασμού, υπερήχων, διαλύματος χλωροφορμίου με ισοαμυλική αλκοόλη, αιθανόλη και κατάψυξη. Η μέθοδος απομόνωσης του βακτηριακού DNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά τα όρια ανίχνευσης των μικροοργανισμών με τις δύο τεχνικές να δίνουν παραπλήσια αποτελέσματα. Η PCR και η LAMP όσον αφορά την ανίχνευσης της Listeria monocytogenes φαίνεται να έχουν και αυτές παραπλήσια αποτελέσματα. Για τα δείγματα που απομονώθηκαν με τη χρήση του εμπορικού kit η PCR είχε όριο ανίχνευσης 102 CFU/mL με την LAMP να έχει 103 CFU/mL, ενώ για την in house τεχνική τα αποτελέσματα ήταν αντίστροφα, με την LAMP να έχει όρια ανίχνευσης 102 CFU/mL και την PCR να έχει 103 CFU/mL. Για την ανίχνευση του βακτηρίου Salmonella Typhimurium τα αποτελέσματα έδειξαν την LAMP να υπερτερεί ελαφρώς της PCR. Τα όρια ανίχνευσης της LAMP και με τις δύο μεθόδους απομόνωσης ήταν 102 CFU/mL, ενώ η PCR παρουσίασε όριο ανίχνευσης 102 CFU/mL με την in house τεχνική και 103 CFU/mL με το εμπορικό kit. Συμπερασματικά, η LAMP φαίνεται όχι μόνο να μην υστερεί αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις να υπερτερεί της PCR αφού παρουσιάζει ελαφρώς αυξημένη ευαισθησία. Επιπροσθέτως η τεχνική της LAMP έδωσε αποτελέσματα σε χρόνο που κυμαίνεται μεταξύ 30 και 60 λεπτών σε σταθερή θερμοκρασία 65oC, ενώ αντίθετα η PCR χρειάστηκε περισσότερο χρόνο για να δώσει αποτελέσματα αφού όχι μόνο απαιτεί θερμικό κύκλο που διαρκεί γύρω στις 3 ώρες αλλά και ηλεκτροφόρηση μετά το πέρας της. Τέλος η LAMP είναι πιο εύχρηστη τεχνική αφού δεν απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμού υψηλού κόστους όπως η PCR κάνοντας την κατάλληλη για ευρεία χρήση σε εργαστήρια με χαμηλούς πόρους

Abstract

Infections caused by foodborne bacteria still remain a controversial subject for public health and society. The number of infections per year is significant and as a result timely and valid bacteria identification is considered a key factor in the food industry. The existing methods are time consuming or demand expensive equipment. Thus an important factor is the development of a new, rapid, and reliable method of detection that can be used promptly. The aim of this research is the evaluation of LAMP (Loop mediated isothermal amplification) for the detection of bacteria in milk samples, the comparison of the sensitivity of PCR and LAMP and the comparison of two different methods of DNA extraction. Milk samples were contaminated with known concentrations of Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes and at the next step the bacterial DNA was extracted. DNA extraction was realized with two different methods. The first method that was used was a commercial kit and the second was an in house technique. The in house technique included boiling, ultrasound, chloroform with isoamyl alcohol, ethanol and freezing. The method of DNA extraction doesn’t seem to affect significantly the limits of detection of PCR and LAMP. The limits of detection of PCR for Listeria monocytogenes that was extracted with the use of the commercial kit was 102 CFU/mL while of LAMP was 103 CFU/mL. Additionally the limits of detection of Listeria monocytogenes that was extracted with the in house technique was 103 CFU/mL for PCR and 102 CFU/mL for LAMP. For Salmonella Typhimurium the results showed that LAMP was slightly more sensitive than PCR. For this pathogen the sensitivity of LAMP was 102 CFU/mL for both extraction techniques, while the limits of detection in PCR was for the commercial kit 103 CFU/mL and for the in house technique 102 CFU/mL. In conclusion, LAMP seems to be as good and at certain circumstances even better than PCR due to better sensitivity. Moreover LAMP provided results in 30 to 60 minutes at the steady temperature of 65oC while PCR needs around 4h since it demands a thermal cycle and an electrophoresis afterwards. Finally LAMP is more practical since it doesn’t require expensive specialized equipment like PCR and can be used in labs with low resources