Οι γονιδιακοί πολυμορφισμοί της SIRT1 ως δείκτες στην εμφάνιση Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου 2

Προύντζου, Ειρήνη

SIRT1 functional polymorphisms as genetic markers of susceptibility to type 2 Diabetes Mellitus

Μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία

Author

Προύντζου, Ειρήνη

Date

2022-05-05

Advisor

HOUHOULA, DIMITRA

Μεταπτυχιακή εργασία (1.180Mb)

ΔΗΛΩΣΗ-ΣΥΓΓΡΑΦΕΑ-ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ-ΕΡΓΑΣΙΑΣ.pdf (85.33Kb)

Keywords

Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 ; Σιρτουϊνη 1 (SIRT1) ; Πολυμορφισμοί

Abstract

Εισαγωγή: Το γενετικό υπόβαθρο αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου στην παθογένεση του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Η σιρτουΐνη 1 (SIRT1) είναι μία NAD+ - εξαρτώμενη αποακετυλάση η οποία ανήκει στην οικογένεια των ρυθμιστών σιωπηλής πληροφορίας 2 (Sir2). Ο ρόλος της έχει επισημανθεί σε μονοπάτια που συνδέονται με ευαισθησία σε αλλαγές στη θρέψη και τη σηματοδότηση ινσουλίνης και αλλά και στη ρύθμιση της ομοιόστασης της γλυκόζης. Πρόσφατες έρευνες έχουν μελετήσει το ρόλο κλειδί της SIRT1 στην αντίσταση στην ινσουλίνη και την εμφάνιση σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Σκοπός: Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η συχνότητα εμφάνισης δύο λειτουργικών πολυμορφισμών μιας βάσης, των rs12778366 (C/T) και rs3758391 (C/T), σε πληθυσμό υγιών ατόμων και ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη και την πιθανότητα συσχέτισής τους με την εμφάνιση της ασθένειας. Μέθοδος: Το δείγμα της μελέτης ήταν συνολικά 49 συμμετέχοντες και αποτελούνταν από 32 εγκυμονούσες ( n=7 με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 , n=12 με σακχαρώδη διαβήτη κύησης, n=4 με προεκλαμψία και n=9 χωρίς κάποια πάθηση) και 17 ασθενείς (n=15 με σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και n=2 χωρίς την πάθηση). Απομονώθηκε αρχικά DNA από τον σκελετικό μυ των εγκυμονουσών και ολικό αίμα από τους ασθενείς. Οι αλληλουχίες – στόχοι των 2 πολυμορφισμών πολλαπλασιάστηκαν μέσω της μεθόδου PCR με την προσθήκη των εκκινητών για τον rs12778366 : forward primer 5’-TAAGGCTTCTAGGACTGGAGATGA-3’ (STR1) και reverse primer 5’-GTCCCTTAAGCCTAGTATGGGTTC-3’ (STR2) και για τον rs3758391 εκκινητές: forward primer 5’-GTCACGCAGGTAATTGATGCAG-3’ (STR3) και reverse primer 5’-GGCTTAGTGGAAAGCCCTTC-3’ (STR4). Ακολούθησε, σε επόμενο στάδιο, χρήση των περιοριστικών ενζύμων HpyCH4III για τον rs12778366 και Ν1aIII για τον rs3758391. Υπολογισμοί και στατιστικές αναλύσεις με τη χρήση του χ2 τεστ (chi-square test) διεξήχθησαν προκειμένου να εξεταστεί η συχνότητα εμφάνισης των διαφορετικών γονοτύπων και η αλληλεπίδραση των αλληλόμορφων με την παρουσία του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2. Αποτελέσματα: Όσον αφορά τον πολυμορφισμό rs12778366, η πλειονότητα των ατόμων της μελέτης έφερε τον γονότυπο ΤΤ χωρίς όμως να υπάρχει διαφορά ανάμεσα στα άτομα που είχαν διαβήτη τύπου 2 και σε αυτά που δεν έφεραν τη νόσο (77,3% vs 66.6%) ενώ παρόμοια τάση παρατηρήθηκε και για τους ετεροζυγώτες στις δύο ομάδες (22,7% vs 33.4%). Επιπροσθέτως, δεν σημειώθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην παρουσία του αλληλόμορφου C και την ευαισθησία στη νόσο (p – value = 0.221˂ 0,05). Για τον πολυμορφισμό rs3758391, ο γονότυπος CT εμφανίζεται σε μεγαλύτερα ποσοστά στα άτομα με σακχαρώδη διαβήτη σε σχέση με όσους δεν έχουν διαβήτη (54,5% vs 33,4%) ενώ ο γονότυπος CC σε μεγαλύτερο ποσοστό στα άτομα που δεν φέρουν τη νόσο συγκριτικά με τους νοσούντες (55,5% vs 36,3%). Ο γονότυπος ΤΤ εμφανίζεται σε παρόμοια ποσοστά στις 2 ομάδες, με σακχαρώδη διαβήτη και μη, σε ποσοστά 9.1% και 11.1% αντίστοιχα. Παρ΄ όλα αυτά το αλληλόμορφο Τ δεν συνδέεται με ευαισθησία στην εμφάνιση σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 p – value = 0.225 < 0.05). Συμπεράσματα: Δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην παρουσία των αλληλόμορφων και τον κίνδυνο εμφάνισης σακχαρώδη διαβήτη για τους δύο πολυμορφισμούς rs12778366 και rs3758391.

Abstract

Introduction: Genetic background is an important risk factor for the pathogenesis of diabetes mellitus type 2. Sirtuin 1 (SIRT1) is a nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD+) dependent deacetylase which belongs to the silent information regulator 2 (Sir2) family of sirtuin histone deacetylases. Its role has been demonstrated in nutrient – sensing and insulin signaling pathways as well as in the regulation of glucose homeostasis. Recent studies have examined the key -role of SIRT1 in insulin resistance and type 2 diabetes. Aim: In the present study we examined the frequency of different genotypes of the one basis polymorphisms rs12778366 (C/T) and rs3758391 (C/T) and investigated potential correlation of the studied variants with the presence of type 2 diabetes mellitus. Methology: The sample of the study was overall 49 subjects and consisted of 32 pregnant women (n=4 with diabetes mellitus type 2, n=15 with gestational diabetes, n=4 with preeclampsia και n=9 healthy subjects) και 17 patients (n=15 with diabetes mellitus type 2 και n=2 non diabetics). Genomic DNA was isolated from skeletal muscle of the pregnants and from total blood of the patients. The target sequences of the two SNPs were multiplied via polymerase chain reaction (PCR) method using the following primers: for the rs12778366, forward primer 5’-TAAGGCTTCTAGGACTGGAGATGA-3’ (STR1) and reverse primer 5’-GTCCCTTAAGCCTAGTATGGGTTC-3’ (STR2) and for the rs3758391, forward primer 5’-GTCACGCAGGTAATTGATGCAG-3’ (STR3) and reverse primer 5’-GGCTTAGTGGAAAGCCCTTC-3’ (STR4). For the next step, the PCR products were digested using HpyCH4III (rs12778366) and Ν1aIII (rs3758391) restriction enzymes. Assessments and statistical analyses were performed using chi – square test to determine the frequency of the studied variants and potential interactions with the presence of type 2 diabetes mellitus. Results: Regarding rs12778366 polymorphism, the vast majority of subjects carried genotype TT in both groups, diabetes and non-diabetes, without difference between them (77.3% vs 66,6%) and same rate was observed for the heterozygous in both groups (22.7% and 33,4% respectively). We found no significant association between rs12778366 polymorphism and an enhanced risk of diabetes mellitus type 2 under allelic C vs. T genetic models (p – value = 0.221 < 0.05). Regarding rs3758391 polymorphism, genotype CT is present to diabetes mellitus group in higher rates compared to non-diabetes group (54.5% vs 33,4%), while genotype CC is present in higher rates to non – diabetes group when compared to diabetes group (55,5% vs 33,4%). Genotype TT is present in same rates to both groups, diabetes and non-diabetes (9,1% and 11,1% respectively). Nevertheless, no significant association was found between T allele and susceptibility to type 2 diabetes mellitus (p – value = 0.225 < 0.05). Discussion: Our results showed no significant association of the studied variants and alleles of the rs12778366 and rs3758391 polymorphisms with the presence of type 2 diabetes mellitus.