Ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένης με ανιχνευτή φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό επιλεγμένων φαινολικών ενώσεων που απαντώνται σε φυτικά εγχύματα

Abstract

Είναι ευρέως αποδεκτό πως ανάμεσα στις διάφορες τεχνικές διαχωρισμού, η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συγκαταλέγεται στις πιο αξιόπιστες τεχνικές ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης πολλών ενώσεων σε ένα μίγμα. Εκμεταλλευόμενη τις διαφορετικές χημικές ιδιότητες (π.χ μέγεθος, πολικότητα ή συγγένεια με τη στατική ή τη κινητή φάση) των προς ανάλυση ενώσεων, η HPLC είναι μια ιδανική τεχνική για τον διαχωρισμό μεγάλης ποικιλίας αναλυτών (π.χ. βιταμίνες, μυκοτοξίνες, βιοδραστικές ενώσεις κ.α). Παρόλα αυτά, ακόμη και στις περιπτώσεις που οι ενώσεις μιας μήτρας «μοιράζονται» παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες, χάρη στην υψηλή εκλεκτικότητα της, η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης είναι σε θέση να διαχωρίσει τους αναλύτες διασφαλίζοντας μια ακριβή ανίχνευση και ποσοτικοποίηση. Η ανάπτυξη της μεθόδου HPLC διαδραματίζει ένα από τους σημαντικότερους ρόλους για την αξιοποίηση των δυνατοτήτων της αλλά και την αντιμετώπιση των περιορισμών της. Τα βασικότερα βήματα τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη της μεθόδου είναι τα ακόλουθα: Πλήρης κατανόηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων της προς ανάλυση μήτρας ή των προς ανάλυση ενώσεων, Επιλογή αρχικών χρωματογραφικών συνθηκών (επιλογή στήλης, τύπος έκλουσης, βελτιστοποίηση σύνθεσης κινητής φάσης, επιλογή ανιχνευτή), Προκατεργασία δείγματος, Βελτιστοποίηση της μεθόδου και τέλος Επικύρωση της μεθόδου. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης ήταν η ανάπτυξη μεθόδου υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συζευγμένη με ανιχνευτή φωτοδιόδων (HPLC-DAD) για τον προσδιορισμό επιλεγμένων ενώσεων όπως τα φαινολικά οξέα από δείγματα εγχυμάτων. Τα φαινολικά οξέα είναι μη φλαβονοειδείς φαινολικές ενώσεις με κοινό χαρακτηριστικό τους την ύπαρξη τουλάχιστον μιας καρβοξυλομάδας στον δακτύλιο του βενζολίου. Από βιοσυνθετικής απόψεως, προέρχονται από δυο κύριες φαινολικές ενώσεις, το βενζοϊκό και το κινναμικό οξύ. Παραδείγματα υδροξυ-βενζοϊκών παραγώγων αποτελούν το γαλλικό οξύ, το p-υδροξυ- βενζοϊκό οξύ, το βανιλικό, το συριγγικό οξύ ενώ το καφεϊκό, το φερουλικό, το σιναπικό και το p-κουμαρικό ανήκουν στα υδροξυ-κινναμικά οξέα. Αξιοσημείωτη είναι και η μεγάλη ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει τα φαινολικά οξέα καθώς τη τελευταία δεκαετία έχουν αναφερθεί πάνω 30 διαφορετικά οξέα με έντονη βιολογική δράση, ενώ βρίσκονται σε αφθονία σε πάρα πολλά φρούτα, λαχανικά, αρωματικά φυτά αλλά και στον καφέ. Συνολικά, η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν βαθμιδωτή χρησιμοποιώντας ως κινητή φάση ένα σύστημα μεθανόλης-νερού-οξικού οξέος 2% με ρυθμό ροής 1mL ανά λεπτό, εγχύοντας 20μL δείγματος και σαρώνοντας για 53 λεπτά στα 280nm. Με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε προσδιορίστηκαν ταυτόχρονα 16 φαινολικά οξέα, ενώ η εφαρμογή της μεθόδου σε επιλεγμένα δείγματα καφέ και παραπροϊόντων αρωματικών φυτών όπως η ρίγανη, τα ρόδα και η λεβάντα φανέρωσε αξιοσημείωτες μεταβολές στο φαινολικό προφίλ. Πιο συγκεκριμένα, στο χλωρογενικό οξύ το οποίο βρίσκεται στη μεγαλύτερη αφθονία στον καφέ παρατηρήθηκε μείωση (από 6mg ανα g ξηρού δείγματος σε 0.5mg ανά g ξηρού δείγματος) ανάλογη με την ένταση του καβουρδίσματος. Όσον αφορά στα παραπροϊόντα αρωματικών φυτών, ανιχνεύθηκαν σε όλα ροσμαρινικό οξύ και 4-υδροξυ βενζοϊκό οξύ. Ωστόσο, σε αντίθεση με τα δείγματα καφέδων, το προφίλ φαινολικών οξέων στα παραπροϊόντα χαρακτηρίστηκε από σημαντικές διακυμάνσεις οι οποίες πιθανόν να οφείλονται σε διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας και διαχείρισης. Η παρούσα μέθοδος μπορεί να βρει εφαρμογή στην ανάλυση τροφίμων ενώ με την επικύρωση της, την διεύρυνση του πεδίου εφαρμογής της και τον εμπλουτισμό των ενώσεων που μπορούν να προσδιοριστούν με αυτή μπορεί να αποτελέσει ένα χρήσιμο και αξιόπιστο αναλυτικό εργαλείο.