Δομική ανάλυση και υπολογιστική στόχευση του υποδοχέα ορμόνης απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης με δυνητικά βιοδραστικά μόρια

Abstract

Η ορμόνη απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone Releasing Hormone, GHRH) είναι ένα νευροπεπτίδιο που αποτελείται από 44 αμινοξέα και παράγεται στον υποθάλαμο. Μετά την σύνθεση της απελευθερώνεται και οδηγείται προς τα σωματοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης όπου προσδένεται με τον υποδοχέα ορμόνης απελευθέρωσης αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone Releasing Hormone Receptor, GHRH-R) διεγείροντας την σύνθεση της αυξητικής ορμόνης (Growth Hormone, GH). Ο GHRH-R ανήκει στην Β οικογένεια των υποδοχέων συζευγμένων με G πρωτεΐνη (G-Proteins Coupled Receptors, GPCRs) και συγκεκριμένα στην Β1 υποκατηγορία των υποδοχέων σεκρετίνης. Σε περιπτώσεις σοβαρών διαταραχών συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παγκρέατος, του μαστού, των ωοθηκών και του προστάτη, ο GHRH-R υπερεκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα καθιστώντας τον έναν πολύ σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η δομική ανάλυση του GHRH-R και η στόχευση του με μικρά μη πεπτιδικά μόρια. Αρχικά γίνεται η δομική ανάλυση του GHRH-R μέσω της μελέτης των αλληλεπιδράσεων που κάνει με το ενδογενές του πεπτίδιο. Έπειτα αναλύεται μια σειρά βιοδραστικών ενώσεων με την ένδειξη “MK”, που έχουν δοκιμαστεί πειραματικά και προέρχονται από δουλειά που έχει προηγηθεί. Στόχος είναι η μελέτη του μηχανισμού πρόσδεσης των ενώσεων στον υποδοχέα. Τέλος εφαρμόζεται η υπολογιστική τεχνική της εικονικής σάρωσης με σκοπό τον εντοπισμό δυνητικά βιοδραστικών μορίων με ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R.

Για την αξιολόγηση της σειράς των βιοδραστικών ενώσεων MK που έχουν δοκιμαστεί πειραματικά εφαρμόστηκε η υπολογιστική τεχνική της μοριακής πρόσδεσης. Για την επιτυχημένη εφαρμογή της μεθόδου απαιτείται μια σειρά από διαδικασίες όπως είναι η προετοιμασία της πρωτεΐνης-στόχου, των προσδετών καθώς και η ρύθμιση ενός συνόλου παραμέτρων. Η μοριακή πρόσδεση έλαβε μέρος στην ορθοστερική θέση της διαμεμβρανικής περιοχής του υποδοχέα τόσο για την ενεργή όσο και την ανενεργή του κατάσταση. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με βάση το σκορ πρόσδεσης αλλά και μέσω των αλληλεπιδράσεων που σχηματίστηκαν μεταξύ των προσδετών και του GHRH-R. Ιδιαίτερη βαρύτητα δόθηκε στις ενώσεις που παρουσίασαν ενθαρρυντικά αποτελέσματα κατά την πειραματική τους δοκιμή. Συγκεκριμένα ξεχώρισε για την αγωνιστική της δράση η ένωση MK24 ενώ για την ανταγωνιστική της δράση η MK04 και οι παρόμοιες με αυτή MK04-6 και MK04-9. Τα υπολογιστικά αποτελέσματα που προέκυψαν ποικίλουν. Ειδικότερα το σκορ πρόσδεσης της ένωσης MK24 δεν αντικατοπτρίζει τα πειραματικά αποτελέσματα. Από την άλλη αλληλεπιδρά με συγκεκριμένα αμινοξέα του υποδοχέα που συμμετέχουν και κατά την διαδικασία σχηματισμού του συμπλόκου GHRHR – GHRH και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγωνιστική δράση της ένωσης MK24. Η σειρά των ενώσεων με ανταγωνιστική δράση MK04, MK04-6 και MK04-9 σημείωσε καλό σκορ πρόσδεσης. Κατά την ανάλυση των αλληλεπιδράσεων τους, παρατηρήθηκε πως οι τρείς ενώσεις έχουν παρόμοιο τρόπο δέσμευσης όμως οι μικρές δομικές διαφορές τους συντελούν σε μοναδικές αλληλεπιδράσεις με τον υποδοχέα. Γενικότερα και οι τρείς ενώσεις αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένα αμινοξέα του υποδοχέα που επιβεβαιώνουν εν μέρη τα πειραματικά αποτελέσματα και την ανταγωνιστική τους δράση.

Στην συνέχεια με σκοπό την ανακάλυψη δυνητικά βιοδραστικών μορίων με ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R εφαρμόστηκε η εικονική σάρωση. Χρησιμοποιήθηκαν δύο χημειοθήκες με 14.511 βιοδραστικές ενώσεις συνολικά οι οποίες αντλήθηκαν ηλεκτρονικά και ακολούθησε η προ-επεξεργασία τους. Αφού πρώτα οι ενώσεις φιλτραρίστηκαν με βάση τον κανόνα των πέντε του Lipinski και προετοιμάστηκαν, ακολούθησε η εφαρμογή της μοριακής πρόσδεσης. Με βάση το σκορ πρόσδεσης ξεχώρισαν οι καλύτερες ενώσεις. Στις ενώσεις αυτές εφαρμόστηκε ο συντελεστής Tanimoto και ξεχώρισαν εκείνες με το χαμηλότερο ποσοστό ομοιότητας που κωδικοποιήθηκαν με τα μοριακά αποτυπώματα RDKit. Ακολούθησε η αξιολόγηση των ενώσεων από την οποία προέκυψαν οι τελικές ενώσεις με πιθανή ανταγωνιστική δράση έναντι του GHRH-R. Μάλιστα από αυτές ξεχώρισε μια ένωση που συνδύαζε καλό σκορ πρόσδεσης και αλληλεπιδράσεις με σημαντικά αμινοξέα του υποδοχέα.