Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρία μάζας με αναλυτή χρόνου πτήσης (LC-QTOF MS) για τον προσδιορισμό μεταβιοτικών
Development and validation of a liquid chromatography time of flight mass spectrometry (LC-QTOF MS) method for the determination of metabiotics
![Thumbnail](/xmlui/bitstream/handle/11400/7402/%ce%91%ce%9b%ce%a5%ce%a3%ce%a3%ce%91%ce%9d%ce%94%ce%a1%ce%91%ce%9a%ce%97%ce%a3_%ce%9c%ce%91%ce%a5%ce%a1%ce%97_%ce%a0%ce%a4%ce%a5%ce%a7%ce%99%ce%91%ce%9a%ce%97%20s.pdf.jpg?sequence=4&isAllowed=y)
Πτυχιακή εργασία
Συγγραφέας
Αλυσσανδράκης, Άγγελος
Μαύρη, Μάρθα
Ημερομηνία
2024-09-05Επιβλέπων
Zoumpoulakis, PanagiotisΛέξεις-κλειδιά
Μεταβιοτικά ; Υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζαςΠερίληψη
Σήμερα, μία νέα κατηγορία ενώσεων, που ονομάζονται μεταβιοτικά (metabiotics), έχει κερδίσει το ενδιαφέρον της βιομηχανίας τροφίμων και συμπληρωμάτων διατροφής. Τα μεταβιοτικά αποτελούν βακτηριακούς μεταβολίτες που έχουν προέλθει μέσω ζύμωσης από ζωντανούς μικροοργανισμούς του εντερικού μικροβιώματος, που χαρακτηρίζονται για τις προβιοτικές τους ιδιότητες. Οι μεταβολίτες αυτοί έχουν αξιοσημείωτες λειτουργίες (πχ. αντιμικροβιακή, αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση), καθώς μπορούν να συνδράμουν στη βελτιστοποίηση της υγείας του ξενιστή. Υπάρχουν πολλές ενώσεις που υπάγονται στα μεταβιοτικά ωστόσο, η παρούσα πτυχιακή εστιάζει σε μεταβιοτικά που αποτελούν μεταβολίτες (πολυ)φαινολικών διατροφικών συστατικών ή ανήκουν σε συμπλέγματα βιταμινών (πχ. βιταμίνες του συμπλέγματος Β). Το έντονο ενδιαφέρον γύρω από τα μεταβιοτικά υπάρχει κυρίως λόγω της συμβολής τους στην αντιμετώπιση κάποιων γνωστών ασθενειών, όπως ο καρκίνος, τα μεταβολικά σύνδρομα, οι παθήσεις του γαστρεντερικού συστήματος, οι καρδιαγγειακές και οι μυϊκές παθήσεις κ.ά. Αξιοσημείωτο είναι ότι έχει ήδη ξεκινήσει η παραγωγή συμπληρωμάτων και σκευασμάτων που περιέχουν τις προαναφερθείσες ενώσεις. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή βρίσκεται ακόμα σε αρχικό στάδιο, και απαιτείται η διεξαγωγή επιπλέον μελετών για να διασφαλιστεί η ποιότητα και η ασφάλεια των τελικών προϊόντων. Για αυτό το λόγο, στα πλαίσια της παρούσας πτυχιακής εργασίας, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μίας μεθόδου υγρής χρωματογραφίας- φασματομετρίας μάζας με τετραπολικό αναλυτή χρόνου πτήσης (liquid chromatography-triple time-of-flight mass spectrometry, LC-ΤTOF MS) για τη ταυτοποίηση 15 μεταβιοτικών, με κατάλληλη ρύθμιση των συνθηκών χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας. Αναλυτικότερα, έγινε βαθμιδωτή έκλουση, η οποία συνίσταται από τους διαλύτες Α [νερό – και 0,1% (v/v) μηρμυγκικό οξύ] και Β [ακετονιτρίλιο – 0,1% (v/v) μυρμηγκικό οξύ], με διάρκεια ανάλυσης 10min σε θετικό και αρνητικό ιοντισμό. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι ενώσεις ουρολιθίνη Α, ουρολιθίνη Β, εντερολακτόνη, εντεροδιόλη, διϋδρορεσβερατρόλη, πολυδατίνη (piceid), κατεχόλη, πυρογαλλόλη, s- εκουόλη, γ- βαλερολακτόνη, πρωτοκατεχικό οξύ, μενακινόνη (βιταμίνη Κ2), θειαμίνη (βιταμίνη Β1), ριβοφλαβίνη( βιταμίνη Β2) και πυριδοξίνη ( βιταμίνη Β6). Από το σύνολο των μελετούμενων ενώσεων, τελικά προσδιορίστηκαν 13 (δεν προσδιορίστηκαν η μενακινόνη και η θειαμίνη) με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε. Έπειτα, ακολούθησε η επικύρωση της μεθόδου με τον προσδιορισμό της γραμμικότητας, της πιστότητας, της ακρίβειας και των ορίων ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ). Από τα αποτελέσματα διεξάγεται το συμπέρασμα ότι η μέθοδος εμφανίζει γραμμικότητα, ικανοποιητική επαναληψιμότητα στο μεσαίο και υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης των πρότυπων διαλυμάτων. Ωστόσο, δεν εμφανίζει ιδιαίτερα ικανοποιητική αναπαραγωγιμότητα, η οποία όμως προβλέπεται να βελτιωθεί με αύξηση των επαναλήψεων των μετρήσεων και την ημερών που πραγματοποιείται η μελέτη αναπαραγωγιμότητας. Η μέθοδος παρουσιάζει ικανοποιητική ακρίβεια. Επιπλέον η πλειοψηφία των μεταβιοτικών μπορούν να ανιχνευτούν και να ποσοτικοποιηθούν σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ανάπτυξη και επικύρωση μιας ή και παραπάνω μεθόδων που θα προσδιορίζουν τους παραγόμενους βακτηριακούς μεταβολίτες διατροφικών συστατικών είναι εξαιρετικής σημασίας για τους τομείς των τροφίμων και της υγείας, καθώς το τωρινό ερευνητικό ενδιαφέρον έχει επικεντρωθεί στις προσπάθειες ενσωμάτωσης των μεταβιοτικών όσο και του συνόλου αδρανοποιημένων βακτηρίων, συστατικών κυτταρικών τοιχωμάτων και μεταβολιτών τους, που είναι γνωστά ως postbiotics, απευθείας μέσα σε προϊόντα τροφίμων, με τη χρήση κάποιων τεχνολογιών όπως η ξήρανση με ψεκασμό, η λυοφιλίωση και η μικροενθυλάκωση.
Περίληψη
Nowadays, a new class of compounds called metabiotics has gained the interest of the food and supplement industry. Metabiotics are bacterial metabolites derived through fermentation from living microorganisms of the intestinal microbiome, characterized by their probiotic properties. These metabolites have remarkable functions (antimicrobial, antioxidant and anti-inflammatory activity), as they can help optimize host health. There are many compounds that belong to the metabiotic group, however, this thesis focuses on metabiotics that are metabolites of (poly)phenolic nutrients or belong to vitamin complexes (e.g. B vitamins). The intense interest in metabiotics is mainly due to their contribution to the treatment of some well-known diseases such as cancer, metabolic syndromes, gastrointestinal diseases, cardiovascular and muscular diseases, etc. It is noteworthy that the production of supplements and preparations containing the aforementioned compounds has already started. However, this process is still at an early stage, and further studies are needed to ensure the quality and safety of the final products. For this reason, in the context of this thesis, a liquid chromatography-triple time-of-flight mass spectrometry (LC-TTOF MS) method was developed for the identification of 15 metabiotics, with appropriate adjustment of the chromatography conditions. More specifically, a gradient elution was performed, consisting of solvents A [water - 0.1% (v/v) formic acid] and B [acetonitrile - 0.1% (v/v) formic acid], with an analysis time of 10 min in positive and negative ionization. More specifically, the compounds urolithin A, urolithin B, enterolactone, enterodiol, dihydroresveratrol, polydatin (piceid), catechol, pyrogallol, s-equol, γ-valerolactone, protocatechuic acid, menaquinone (vitamin K2), thiamine (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2) and pyridoxine (vitamin B6) were studied. Of the total number of compounds studied, 13 compounds were finally identified (menaquinone and thiamine were not identified) by the method developed. The method was then validated by determining the linearity, precision, accuracy, and limits of detection (LOD) and quantification (LOQ). From the results it is concluded that the method shows linearity, good repeatability at medium and high concentration level of the standard solutions. However, it does not demonstrate particularly satisfactory reproducibility, but this is expected to improve with an increase in the number of measurement replicates and the number of days the reproducibility study is carried out. The method shows satisfactory accuracy. In addition, the majority of metabiotics can be detected and quantified at low concentrations. The development and validation of one or more methods to identify the produced bacterial metabolites of dietary ingredients is of great importance for the food and health sectors, as current research interest has focused on efforts to introduce both metabiotic and inactivated bacteria, cell wall components and their metabolites, known as postbiotics, directly into food products, using some technologies such as spray drying, lyophilisation and microencapsulation.