Ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρία μάζας με αναλυτή χρόνου πτήσης (LC-QTOF MS) για τον προσδιορισμό μεταβιοτικών

Abstract

Σήμερα, μία νέα κατηγορία ενώσεων, που ονομάζονται μεταβιοτικά (metabiotics), έχει κερδίσει το ενδιαφέρον της βιομηχανίας τροφίμων και συμπληρωμάτων διατροφής. Τα μεταβιοτικά αποτελούν βακτηριακούς μεταβολίτες που έχουν προέλθει μέσω ζύμωσης από ζωντανούς μικροοργανισμούς του εντερικού μικροβιώματος, που χαρακτηρίζονται για τις προβιοτικές τους ιδιότητες. Οι μεταβολίτες αυτοί έχουν αξιοσημείωτες λειτουργίες (πχ. αντιμικροβιακή, αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση), καθώς μπορούν να συνδράμουν στη βελτιστοποίηση της υγείας του ξενιστή. Υπάρχουν πολλές ενώσεις που υπάγονται στα μεταβιοτικά ωστόσο, η παρούσα πτυχιακή εστιάζει σε μεταβιοτικά που αποτελούν μεταβολίτες (πολυ)φαινολικών διατροφικών συστατικών ή ανήκουν σε συμπλέγματα βιταμινών (πχ. βιταμίνες του συμπλέγματος Β). Το έντονο ενδιαφέρον γύρω από τα μεταβιοτικά υπάρχει κυρίως λόγω της συμβολής τους στην αντιμετώπιση κάποιων γνωστών ασθενειών, όπως ο καρκίνος, τα μεταβολικά σύνδρομα, οι παθήσεις του γαστρεντερικού συστήματος, οι καρδιαγγειακές και οι μυϊκές παθήσεις κ.ά. Αξιοσημείωτο είναι ότι έχει ήδη ξεκινήσει η παραγωγή συμπληρωμάτων και σκευασμάτων που περιέχουν τις προαναφερθείσες ενώσεις. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή βρίσκεται ακόμα σε αρχικό στάδιο, και απαιτείται η διεξαγωγή επιπλέον μελετών για να διασφαλιστεί η ποιότητα και η ασφάλεια των τελικών προϊόντων. Για αυτό το λόγο, στα πλαίσια της παρούσας πτυχιακής εργασίας, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μίας μεθόδου υγρής χρωματογραφίας- φασματομετρίας μάζας με τετραπολικό αναλυτή χρόνου πτήσης (liquid chromatography-triple time-of-flight mass spectrometry, LC-ΤTOF MS) για τη ταυτοποίηση 15 μεταβιοτικών, με κατάλληλη ρύθμιση των συνθηκών χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας. Αναλυτικότερα, έγινε βαθμιδωτή έκλουση, η οποία συνίσταται από τους διαλύτες Α [νερό – και 0,1% (v/v) μηρμυγκικό οξύ] και Β [ακετονιτρίλιο – 0,1% (v/v) μυρμηγκικό οξύ], με διάρκεια ανάλυσης 10min σε θετικό και αρνητικό ιοντισμό. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν οι ενώσεις ουρολιθίνη Α, ουρολιθίνη Β, εντερολακτόνη, εντεροδιόλη, διϋδρορεσβερατρόλη, πολυδατίνη (piceid), κατεχόλη, πυρογαλλόλη, s- εκουόλη, γ- βαλερολακτόνη, πρωτοκατεχικό οξύ, μενακινόνη (βιταμίνη Κ2), θειαμίνη (βιταμίνη Β1), ριβοφλαβίνη( βιταμίνη Β2) και πυριδοξίνη ( βιταμίνη Β6). Από το σύνολο των μελετούμενων ενώσεων, τελικά προσδιορίστηκαν 13 (δεν προσδιορίστηκαν η μενακινόνη και η θειαμίνη) με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε. Έπειτα, ακολούθησε η επικύρωση της μεθόδου με τον προσδιορισμό της γραμμικότητας, της πιστότητας, της ακρίβειας και των ορίων ανίχνευσης (LOD) και ποσοτικοποίησης (LOQ). Από τα αποτελέσματα διεξάγεται το συμπέρασμα ότι η μέθοδος εμφανίζει γραμμικότητα, ικανοποιητική επαναληψιμότητα στο μεσαίο και υψηλό επίπεδο συγκέντρωσης των πρότυπων διαλυμάτων. Ωστόσο, δεν εμφανίζει ιδιαίτερα ικανοποιητική αναπαραγωγιμότητα, η οποία όμως προβλέπεται να βελτιωθεί με αύξηση των επαναλήψεων των μετρήσεων και την ημερών που πραγματοποιείται η μελέτη αναπαραγωγιμότητας. Η μέθοδος παρουσιάζει ικανοποιητική ακρίβεια. Επιπλέον η πλειοψηφία των μεταβιοτικών μπορούν να ανιχνευτούν και να ποσοτικοποιηθούν σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ανάπτυξη και επικύρωση μιας ή και παραπάνω μεθόδων που θα προσδιορίζουν τους παραγόμενους βακτηριακούς μεταβολίτες διατροφικών συστατικών είναι εξαιρετικής σημασίας για τους τομείς των τροφίμων και της υγείας, καθώς το τωρινό ερευνητικό ενδιαφέρον έχει επικεντρωθεί στις προσπάθειες ενσωμάτωσης των μεταβιοτικών όσο και του συνόλου αδρανοποιημένων βακτηρίων, συστατικών κυτταρικών τοιχωμάτων και μεταβολιτών τους, που είναι γνωστά ως postbiotics, απευθείας μέσα σε προϊόντα τροφίμων, με τη χρήση κάποιων τεχνολογιών όπως η ξήρανση με ψεκασμό, η λυοφιλίωση και η μικροενθυλάκωση.