Ανίχνευση και ταυτοποίηση παθογόνων βακτηρίων σε δείγματα τροφίμων με τη χρήση καινοτόμων μοριακών τεχνικών

Μαγουλάς, Σωτήριος

Detection and identification of bacterial pathogens in food samples with innovative molecular techniques

Πτυχιακή εργασία

Author

Μαγουλάς, Σωτήριος

Date

2022-07-12

Advisor

HOUHOULA, DIMITRA

ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΜΑΓΟΥΛΑΣ ΣΩΤΗΡΙΟΣ.pdf (2.439Mb)

Keywords

Μοριακές μέθοδοι

Abstract

Οι τροφιμογενείς λοιμώξεις είναι ένα από τα σημαντικότερα θέματα που αφορούν, τη βιομηχανία των τροφίμων και την παγκόσμια υγεία. Ο υψηλός αριθμός ετήσιων λοιμώξεων καθιστά την έγκαιρη και έγκυρη ανίχνευση των παθογόνων βακτηρίων στα τρόφιμα κρίσιμο σημείο ελέγχου κατά την παραγωγή και επεξεργασία των τροφίμων. Οι διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των παθογόνων βακτηρίων είναι χρονοβόρες έχουν υψηλό κόστος και απαιτούν εξειδικευμένο εξοπλισμό. Συνεπώς υπάρχει ανάγκη για ανάπτυξη νέων, ταχέων και αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης παθογόνων μικροοργανισμών οι οποίες θα μπορούν να αξιοποιηθούν άμεσα από την βιομηχανία των τροφίμων. Η παρούσα εργασία συγκρίνει την ευαισθησία της μεθόδου ισοθερμικής ενίσχυσης μέσω βρόγχου (Loop-mediated isothermal amplification– LAMP) με τη μέθοδο της PCR, καθώς και δύο μεθόδους απομόνωσης του βακτηριακού DNA σε διαφορετικές συγκεντρώσεις τριών βακτηρίων μεγάλου ενδιαφέροντος. Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes και Escherichia coli. Ακόμη δοκιμάζει 3D εκτυπωμένες συσκευές – τσιπ (microfluidic devices) που εφαρμόζουν τις αρχές της μικρορευστομηχανικής. Η απομόνωση του DNA των παθογόνων βακτηρίων πραγματοποιήθηκε με δύο διαφορετικές μεθόδους. Με το εμπορικό kit απομόνωσης DNA NucleoSpin® Food και με μία in-house τεχνική που περιλάμβανε την χρήση βρασμού, υπερήχων, διαλύματος χλωροφορμίου με ισοαμυλική αλκοόλη, αιθανόλη και κατάψυξη. Η μέθοδος απομόνωσης του βακτηριακού DNA φαίνεται να μην επηρεάζει σημαντικά τα όρια ανίχνευσης των μικροοργανισμών. Η μέθοδος LAMP έδωσε αποτελέσματα σε χρόνο που δεν υπερβαίνει τα 60 λεπτά, σε σταθερή θερμοκρασία 65 ℃, ενώ αντίθετα η PCR χρειάστηκε περισσότερο χρόνο για να δώσει αποτελέσματα αφού όχι μόνο απαιτεί θερμικούς κύκλους που διαρκεί περίπου 3 ώρες, αλλά και ηλεκτροφόρηση για να αναγνωστούν τα αποτελέσματά της. Η LAMP είναι πιο εύχρηστη τεχνική αφού δεν απαιτεί εξειδικευμένο εξοπλισμό υψηλού κόστους, γεγονός που την καθιστά κατάλληλη για χρήση σε εργαστήρια με χαμηλούς πόρους. Στα εκτυπωμένα τσιπ μικρορευστομηχανικής δοκιμάστηκαν δείγματα που ανιχνεύτηκαν με τη LAMP, δίνοντας αξιόπιστα και επαναλήψιμα αποτελέσματα.

Abstract

Foodborne infections are one of the most important issues for the food industry and global health. The high number of annual infections makes the timely and valid detection of pathogenic bacteria in food a critical control point in the production and processing of food in the food industry. The procedures used to detect pathogenic bacteria are time consuming, costly and require specialized equipment. There is therefore a need to develop new, rapid and reliable methods for detecting pathogenic microorganisms that can be used directly by the food industry. The present study compares the sensitivity of the LAMP method with the PCR method, as well as two methods of extraction and bacterial DNA isolation at different concentrations of three bacteria of great interest. Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes and Escherichia coli. It also evaluates 3D printed chip devices that apply the principles of microfluidics. DNA isolation of pathogenic bacteria was performed by two different methods. With the commercial DNA NucleoSpin® Food isolation kit and with an in- house technique that included the use of boiling, ultrasound, chloroform solution with isoamyl alcohol, ethanol and freezing. The bacterial DNA isolation technique does not seem to significantly affect the limits of detection of the microorganisms. LAMP gave results in a time not exceeding 60 minutes, at a constant temperature of 65 ℃, while PCR took longer to give results as it not only requires a thermal cycle that lasts about 3 hours, but also electrophoresis technique to show results. LAMP is a more user-friendly technique as it does not require specialized or high-cost equipment, which makes it suitable for use in laboratories with low resources. Samples detected with LAMP were tested on the printed microfluidic chips, giving reliable and repeatable results.